導(dǎo)讀：
影響因子： 13.44
PMID：32651212
期刊年卷：Sci Immunol 2020 07 10;549(49)
DOI：10.1126/sciimmunol.abd1554
導(dǎo)讀： http://www.ebiotrade.com/newsf/2020-7/2020714172546874.htm
《科學(xué)免疫學(xué)》（Science Immunology）上發(fā)表的一篇論文中嚷往，韓國研究人員表示哟旗，他們使用10x Genomics scRNA-seq平臺(tái)對來自四名健康捐獻(xiàn)者揽思，八名輕度或重度COVID患者的外周血單核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序-19，以及5名重度流感患者埃碱，以識(shí)別導(dǎo)致COVID-19嚴(yán)重進(jìn)展的因素。
他們發(fā)現(xiàn)森瘪，與嚴(yán)重流感患者相比闯狱，COVID-19患者在PBMC的所有細(xì)胞類型中均表現(xiàn)出高炎癥特征渊涝，尤其是TNF /IL-1β驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)的上調(diào)慎璧。他們還觀察到在嚴(yán)重COVID-19患者的經(jīng)典單核細(xì)胞中床嫌，I型IFN反應(yīng)與TNF /IL-1β驅(qū)動(dòng)的炎癥共存，但在COVID-19較輕的患者中未觀察到胸私。有趣的是厌处，研究人員還在重癥流感患者中觀察到了I型IFN驅(qū)動(dòng)的炎癥特征。
作為免疫學(xué)變化的特征岁疼，研究人員調(diào)查了疾病組與健康供體組相比阔涉，PBMC中免疫細(xì)胞的相對比例。與輕度COVID-19的有限變化不同捷绒，他們發(fā)現(xiàn)PBMC中跨多種細(xì)胞類型的流感和嚴(yán)重COVID-19都有顯著變化瑰排。在嚴(yán)重的COVID-19中，他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)典單核細(xì)胞的比例顯著增加暖侨，而樹突狀細(xì)胞（DC）椭住，非經(jīng)典單核細(xì)胞，中間單核細(xì)胞字逗，自然殺傷（NK）細(xì)胞京郑，效應(yīng)記憶（EM）樣CD8 + T細(xì)胞和EM樣CD4 + T細(xì)胞明顯減少。在嚴(yán)重流感中葫掉，研究人員發(fā)現(xiàn)經(jīng)典單核細(xì)胞的比例顯著增加些举，而DC，非EM樣CD4 + T細(xì)胞俭厚，EM樣CD4 + T細(xì)胞户魏，IgG + B細(xì)胞，
為了比較不同疾病之間的感染效果套腹，研究人員隨后根據(jù)與健康供體組相比相對基因表達(dá)變化進(jìn)行了分級(jí)聚類绪抛。出乎意料的是，他們發(fā)現(xiàn)PBMC中的所有細(xì)胞類型都是按疾病組而不是按細(xì)胞類型聚集在一起的电禀。進(jìn)一步的分析表明幢码，在COVID-19中，不管細(xì)胞類型如何尖飞，外周血免疫細(xì)胞都可能受到常見炎癥介質(zhì)的影響症副。此外，盡管COVID-19和流感病毒具有自己獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征政基，但嚴(yán)重的COVID-19和流感病毒在所有類型的單核細(xì)胞和DC中共享轉(zhuǎn)錄特征贞铣，可能反映了在嚴(yán)重流感病毒和嚴(yán)重COVID-19中固有免疫應(yīng)答的共同機(jī)制。
研究人員接下來分析了三種類型的單核細(xì)胞簇沮明，以發(fā)現(xiàn)COVID-19特異性亞簇辕坝。他們特別關(guān)注經(jīng)典單核細(xì)胞，考慮到它們在炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用荐健，并研究了流感和COVID-19之間差異表達(dá)的基因酱畅，以便在經(jīng)典單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)COVID-19特異性的轉(zhuǎn)錄特征琳袄。
他們發(fā)現(xiàn)，除了TNF /IL-1β反應(yīng)基因外纺酸，COVID-19特異性基因還富含TNF /IL-1β反應(yīng)基因窖逗，而流感特異性基因則富含IFN-I反應(yīng)基因。與COVID-19相比餐蔬，IFN-I反應(yīng)在流感中占主導(dǎo)地位碎紊。出乎意料的是，他們還觀察到嚴(yán)重的COVID-19除具有TNF /IL-1β炎癥功能外樊诺，還具有IFN-I響應(yīng)功能仗考。
最后，研究人員使用從致命COVID-19患者的死后肺組織獲得的大量RNA-seq數(shù)據(jù)驗(yàn)證了IFN-I反應(yīng)和炎性特征啄骇。盡管分析僅限于兩名患者痴鳄，但他們突出顯示了IFN-I反應(yīng)和TNF /IL-1β-炎癥反應(yīng)。
“在當(dāng)前的研究中缸夹，作者證明了嚴(yán)重的COVID-19的特征在于TNF /IL-1β的炎性特征以及IFN-I反應(yīng)磕诊。在SARS-CoV感染的小鼠模型中呜师，IFN-I反應(yīng)的時(shí)機(jī)是決定感染結(jié)果的關(guān)鍵因素。”作者總結(jié)說屠列√浼纾“延遲的IFN-I反應(yīng)可導(dǎo)致病理性炎癥弛车，而早期的IFN-I反應(yīng)可控制病毒復(fù)制脓豪。因此，作者提出了不僅針對炎癥細(xì)胞因子（包括TNF匆笤，IL-1β和IL-6）的抗炎策略研侣，還針對病理性對于嚴(yán)重COVID-19的患者，需要研究IFN-1的應(yīng)答炮捧∈睿”
COVID-19和流感的免疫分型突出了I型干擾素在嚴(yán)重COVID-19
摘要
盡管大多數(shù)嚴(yán)重的急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2）感染的人都患有輕度的冠狀病毒病2019（COVID-19），但一些患者患有嚴(yán)重的COVID-19咆课，并伴有急性呼吸窘迫綜合癥和全身性炎癥末誓。為了確定驅(qū)動(dòng)COVID-19嚴(yán)重進(jìn)展的因素，作者使用從健康供體书蚪，輕度或重度COVID-19患者以及重度流感患者獲得的外周血單核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序喇澡。與嚴(yán)重流感相比，COVID-19患者在PBMC的所有細(xì)胞中均表現(xiàn)出高炎癥特征殊校，尤其是腫瘤壞死因子/白介素-1β（TNF /IL-1β）驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)上調(diào)晴玖。在來自嚴(yán)重COVID-19患者的經(jīng)典單核細(xì)胞中，I型干擾素（IFN）反應(yīng)與TNF /IL-1β驅(qū)動(dòng)的炎癥共存，在COVID-19較輕的患者中未見到呕屎。作者還記錄了I型IFN驅(qū)動(dòng)的嚴(yán)重流感患者的炎癥特征宪萄。在此基礎(chǔ)上，作者提出I型IFN反應(yīng)在嚴(yán)重COVID-19的炎癥加重中起關(guān)鍵作用榨惰。
介紹
目前，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀2（SARS-COV-2）静汤，這將導(dǎo)致冠狀病毒病2019（COVID-19）琅催，是全球范圍內(nèi)傳播（1，2）和世界衛(wèi)生組織已宣布它大流行虫给。截至2020年6月2日藤抡，全世界報(bào)告的確診病例超過610萬，死亡人數(shù)超過37.6萬（3）抹估。
SARS-CoV-2感染通常會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)感染個(gè)體自發(fā)消退的輕度疾病進(jìn)程（4）缠黍。然而，一些病人药蜻，特別是老年患者瓷式，出現(xiàn)嚴(yán)重COVID-19感染，需要重癥監(jiān)護(hù)機(jī)械通氣（4语泽，5）贸典。在中國武漢，COVID-19的死亡率估計(jì)為1.4％（5）踱卵。盡管該發(fā)病率低于由其他人類病原體冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥（SARS）和中東呼吸綜合癥（6）廊驼，但仍遠(yuǎn)高于流感，流感是需要住院和治療的常見呼吸道病毒性疾病惋砂。重癥監(jiān)護(hù)室妒挎。
在嚴(yán)重的COVID-19病例中，已經(jīng)觀察到一種高炎癥反應(yīng)西饵，也稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴酝掩，并被懷疑會(huì)導(dǎo)致COVID-19的有害發(fā)展（7）。在嚴(yán)重的情況下罗标，包括腫瘤壞死因子（TNF）和白介素6（IL-6）在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的循環(huán)水平會(huì)增加（8）庸队。基因表達(dá)分析還顯示闯割，在嚴(yán)重情況下彻消，IL-1相關(guān)的促炎途徑高度上調(diào)（9）。在SARS-CoV感染的小鼠模型中宙拉，延遲但相當(dāng)大的I型干擾素（IFN-I）反應(yīng)促進(jìn)單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的積累和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生宾尚，導(dǎo)致致命性肺炎，并伴有血管滲漏和病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)受損（10）。
在COVID-19的患者中也觀察到免疫功能障礙煌贴。在嚴(yán)重的情況下御板，T細(xì)胞的絕對數(shù)量減少（8，11）牛郑，和T細(xì)胞表現(xiàn)出與抑制性受體（表達(dá)功能衰竭12怠肋，13）。然而淹朋，在致命的COVID-19病例中笙各，也報(bào)道了CD38，人類白細(xì)胞抗原（HLA）–DR和細(xì)胞毒性分子上調(diào)所反映的T細(xì)胞過度活化（14）础芍。重度COVID-19患者的免疫功能障礙可歸因于促炎性細(xì)胞因子（15）杈抢。
在本研究中，作者使用外周血單核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）仑性，以鑒定與嚴(yán)重COVID-19感染發(fā)展相關(guān)的因素惶楼。通過比較COVID-19和嚴(yán)重流感，作者報(bào)告了TNF /IL-1β驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)在PBMC中所有類型的細(xì)胞中在COVID-19中占主導(dǎo)地位诊杆，而各種IFN刺激基因（ISG）的上調(diào)在嚴(yán)重流感中表現(xiàn)突出歼捐。當(dāng)作者比較輕度和重度COVID-19感染患者的免疫反應(yīng)時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)重度COVID-19的經(jīng)典單核細(xì)胞除TNF /IL-1β驅(qū)動(dòng)的炎癥外晨汹，還表現(xiàn)出IFN-I驅(qū)動(dòng)的特征窥岩。
結(jié)果
來自COVID-19和流行性感冒患者的PBMC單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組
PBMC收集自健康供體（n = 4），住院的嚴(yán)重流感患者（n = 5）和臨床嚴(yán)重程度各不相同（包括嚴(yán)重宰缤，輕度和無癥狀）的COVID-19患者（n = 8）颂翼。在住院期間的不同時(shí)間從八名COVID-19患者中的三名（患者C3，C6和C7）中兩次獲得PBMC慨灭。根據(jù)全血采樣當(dāng)天評(píng)估的國家早期預(yù)警評(píng)分（NEWS朦乏；輕度<5，重度≥5）氧骤，將COVID-19患者的PBMC標(biāo)本分為重度或輕度COVID-19組（16）呻疹。在NEWS評(píng)分中，評(píng)估了呼吸頻率筹陵，氧飽和度刽锤，氧氣補(bǔ)充量，體溫朦佩，收縮壓并思，心率和意識(shí)（16）。無論是否需要NEWS評(píng)分语稠，何時(shí)需要住院均定義為嚴(yán)重流感宋彼。在COVID-19出現(xiàn)之前弄砍，從2015年12月至2016年4月登記了重度流感患者。與輕度COVID-19組相比输涕，重度COVID-19組在采血之日的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低音婶，血清C反應(yīng)蛋白水平更高（圖S1A）。對SARS-CoV-2的N莱坎，RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）和E基因進(jìn)行了多重實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）衣式，兩組之間所有三個(gè)基因的Ct值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖S1B）。
人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息在表S1中提供了實(shí)驗(yàn)性的scRNA-seq批次檐什，在表S2和S3中提供了臨床數(shù)據(jù)瞳收。
使用10x Genomics scRNA-seq平臺(tái)，作者以嚴(yán)格的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)后厢汹，在所有患者中共分析了59,572個(gè)細(xì)胞，平均每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生6900個(gè)唯一分子標(biāo)識(shí)符（UMI）谐宙，平均每個(gè)細(xì)胞檢測1900個(gè)基因（表S4）烫葬。生物學(xué)復(fù)制品（同一組中的PBMC標(biāo)本）的轉(zhuǎn)錄組圖譜可高度重現(xiàn)（圖S1C），從而確保了本研究中生成的scRNA-seq數(shù)據(jù)的高質(zhì)量凡蜻。
為了以特定細(xì)胞類型檢查宿主的免疫反應(yīng)搭综，作者使用Seurat軟件包對59,572個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了基于高度可變基因的t分布隨機(jī)鄰居嵌入（tSNE）（17），并確定了22個(gè)不受患者或?qū)嶒?yàn)偏見的不同簇批次的scRNA-seq（圖1A和圖S1D）划栓。根據(jù)眾所周知的標(biāo)記基因和兩個(gè)未分類的簇兑巾，將這些簇分配給13種不同的細(xì)胞類型（圖1，B和C忠荞，以及表S5）蒋歌。在下游分析，作者只集中在11種不同的免疫細(xì)胞類型委煤，包括免疫球蛋白G -（IgG抗體-）B細(xì)胞堂油，IgG的+ B細(xì)胞，效應(yīng)記憶（EM）樣CD4 +T細(xì)胞碧绞，非EM樣CD4 + T細(xì)胞府框，非EM樣CD8 + T細(xì)胞，非EM樣CD8 + T細(xì)胞讥邻，自然殺傷（NK）細(xì)胞迫靖，經(jīng)典單核細(xì)胞，中間單核細(xì)胞兴使，非經(jīng)典單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）排除血小板系宜，紅細(xì)胞（RBC）和兩個(gè)未分類的簇。由于缺乏重復(fù)发魄，個(gè)體C8（無癥狀病例）也被排除在外蜈首。在分級(jí)聚類中，來自同一細(xì)胞類型的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄組圖譜傾向于聚在一起，然后是疾病組欢策，這表明免疫細(xì)胞類型和疾病生物學(xué)而非技術(shù)偽像是可變免疫轉(zhuǎn)錄組的主要驅(qū)動(dòng)力（圖S1E） ）吆寨。
圖1 來自COVID-19和流感患者的PBMC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。
（A）來自健康捐獻(xiàn)者（HD）的59,572個(gè)PBMC的tSNE預(yù)測（四個(gè)樣本踩寇，17,590個(gè)細(xì)胞）啄清，
嚴(yán)重流感（FLU）患者（五個(gè)樣本，10,519個(gè)細(xì)胞）俺孙，
COVID-19患者（無癥狀：一個(gè)樣本辣卒，4425個(gè)細(xì)胞） ；
輕度COVID-19：四個(gè)樣本睛榄，共16,742個(gè)細(xì)胞荣茫；
重度COVID-19：六個(gè)樣本，共10,296個(gè)細(xì)胞）场靴，以組信息進(jìn)行著色啡莉。
（B）在tSNE圖上的已知標(biāo)記基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)。
（C）tSNE圖由帶注釋的細(xì)胞類型著色旨剥。
（D）除未分類的1咧欣，未分類的2，RBC和血小板以外的各組細(xì)胞類型的比例轨帜。顏色表示細(xì)胞類型信息魄咕。
（E）箱形圖顯示輕度COVID-19（n= 4），重度COVID-19（n = 6）和FLU（n = 5）與HD組相比（輕度COVID-19與HD：n = 16;重度COVID-19與HD：n = 24; FLU與高清：n = 20）蚌父。對于箱線圖哮兰，該框表示四分位間距（IQR），而晶須對應(yīng)于1.5×IQR內(nèi)的最高和最低點(diǎn)苟弛。未分類1（每個(gè)細(xì)胞的UMI相對較高奠蹬，并且存在多個(gè)標(biāo)記基因），未分類2（B細(xì)胞樣且核糖體蛋白基因的高表達(dá)）嗡午，RBC和血小板被排除囤躁。對疾病和HD組之間的每種細(xì)胞類型進(jìn)行了雙面KS測試。* P <0.05荔睹，** P <0.01和*** P <0.001狸演。
作為免疫學(xué)變化的特征，作者調(diào)查了疾病組與健康供體組相比PBMC中免疫細(xì)胞的相對比例（圖1僻他，D和E宵距，以及圖S1F）。與輕度COVID-19的有限變化不同吨拗，在PBMC中跨多種細(xì)胞類型的流感和嚴(yán)重COVID-19均觀察到了顯著變化满哪。在嚴(yán)重的COVID-19中婿斥，經(jīng)典單核細(xì)胞的比例顯著增加，而DC哨鸭，非經(jīng)典單核細(xì)胞民宿，中間單核細(xì)胞，NK細(xì)胞像鸡，EM樣CD8 + T細(xì)胞和EM樣CD4 + T細(xì)胞的比例顯著下降（圖1E） 活鹰。在嚴(yán)重流感中，經(jīng)典單核細(xì)胞的比例顯著增加只估，而DC志群，非EM樣CD4 +T細(xì)胞，EM樣CD4 + T細(xì)胞蛔钙，IgG + B細(xì)胞和IgG - B細(xì)胞顯著減少锌云。作者通過流式細(xì)胞儀分析驗(yàn)證了來自scRNA-seq的免疫細(xì)胞亞群的比例。來自scRNA-seq的總淋巴細(xì)胞吁脱，B細(xì)胞桑涎，CD4 + T細(xì)胞，CD8 + T細(xì)胞豫喧，NK細(xì)胞和總單核細(xì)胞的相對比例與流式細(xì)胞儀分析的相對比例顯著相關(guān)（圖S1G）。
與COVID-19相關(guān)的轉(zhuǎn)錄簽名
為了比較不同疾病之間感染的影響幢泼，作者基于相對于健康供體組的相對基因表達(dá)變化進(jìn)行了分層聚類紧显。出乎意料的是，PBMC中的所有類型的細(xì)胞都根據(jù)疾病組而不是細(xì)胞類型聚集在一起（圖2A）缕棵》醢啵基于K的可變基因的進(jìn)一步研究-均值聚類支持PBMC中所有類型細(xì)胞上COVID-19特異性上調(diào)或下調(diào)的基因表達(dá)模式（圖S2A）。這些結(jié)果表明招驴，在COVID-19中篙程，不管細(xì)胞類型如何，外周血免疫細(xì)胞都可能受到常見炎癥介質(zhì)的影響别厘。盡管在COVID-19和流感之間有明顯的轉(zhuǎn)錄特征虱饿，但嚴(yán)重的COVID-19和流感在所有類型的單核細(xì)胞和DC中共享轉(zhuǎn)錄特征（圖2A中的黑框區(qū)域），這可能反映了在嚴(yán)重的流感和嚴(yán)重的COVID-19先天性先天免疫應(yīng)答中潛在的共同機(jī)制触趴。
圖2 COVID-19的免疫情況氮发。
（A）在細(xì)胞類型分辨率中使用疾病之間的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)錄組的PCC進(jìn)行分層聚類（n = 33）。熱圖的顏色強(qiáng)度指示PCC值冗懦。熱圖上方的顏色條指示細(xì)胞類型和疾病組爽冕。黑框表示嚴(yán)重COVID-19和FLU組之間高度相關(guān)的細(xì)胞類型。
（B）在COVID-19和FLU患者中DEG的選擇GO生物學(xué)途徑（n = 49）的富集P值的圖示（左披蕉，六列：與HD相比颈畸，COVID-19和FLU組的DEGs;右乌奇，兩個(gè)列：COVID-19和FLU組之間的DEG）。MHC眯娱，主要組織相容性復(fù)合體礁苗。
（C）tSNE圖代表GBP1（FLU特異性），CREM（COVID-19特異性）和CCL3（COVID-19 / FLU常見）的代表性基因表達(dá)模式困乒。
（D）上圖：使用屬于（B）中選定生物學(xué)途徑的基因的COVID-19和FLU組之間的相對歸一化基因表達(dá)寂屏，通過WGCNA分析得到樹狀圖（n = 316）。下圖：COVID-19和FLU組之間相對標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)的熱圖娜搂。彩色條（左）表示基于PCC的基于相對標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)的層次聚類所聚類的細(xì)胞類型信息迁霎。
WGCNA的模塊化基因表達(dá)模式一起顯示（G1，n = 10百宇； G2考廉，n= 147; G3，n = 27携御；G4昌粤，n = 17；G5啄刹，n = 12涮坐；G6，n = 64誓军；G7袱讹，n = 34；G8昵时，n = 5）捷雕。
接下來，作者試圖根據(jù)基因本體論（GO）生物途徑確定疾病特異性上調(diào)或下調(diào)基因中的相關(guān)生物學(xué)功能壹甥。首先救巷，作者將輕度和重度COVID-19合并為一個(gè)COVID-19組，并使用基于模型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)（MAST）分析與健康供體組相比句柠，鑒定了每種細(xì)胞類型的疾病特異性基因變化（18）浦译。NFKB1，NFKB2溯职，IRF1管怠，和CXCR3被特異性上調(diào)在COVID-19，和CXCL10缸榄，STAT1渤弛，TLR4，和II類HLA基因和免疫蛋白酶亞基特別是在流感（表S6）上調(diào)甚带。壞死因子她肯，TGFB1佳头，IL1B和IFNG通常被上調(diào)。當(dāng)作者直接比較COVID-19和流感時(shí)晴氨，在COVID-19中NFKB1康嘉，NFKB2和TNF上調(diào)，而在流感中STAT1籽前，TLR4和免疫蛋白酶亞基的基因上調(diào)亭珍。對于每組差異表達(dá)基因（DEG），作者確定了前10個(gè)富集的GO生物學(xué)途徑枝哄，并收集它們以證明每組DEG中的P值富集（圖2B）肄梨。）。炎癥反應(yīng)基因在COVID-19和流感中均具有高活性挠锥，從而鑒定出獨(dú)特和常見的生物學(xué)功能众羡，但轉(zhuǎn)錄因子（包括炎癥因子（即NFKB1 / 2和STAT4））的基因在COVID中上調(diào)-19。相反蓖租，與流感相比粱侣，在COVID-19中觀察到與IFN-1和IFN-II信號(hào)傳導(dǎo)途徑，T細(xì)胞受體途徑以及適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)的基因響應(yīng)有限蓖宦。在流感齐婴，CREM中特異性上調(diào)的GBP1（IFN-γ介導(dǎo)的信號(hào)通路）以單細(xì)胞分辨率為例，說明了這種疾病特異性基因表達(dá)模式（轉(zhuǎn)錄的陽性調(diào)節(jié)）在COVID-19中被特異性上調(diào)稠茂，而CCL3（炎癥反應(yīng)）通常在上調(diào)（圖2C和表S7）柠偶。
通過對與圖2B相關(guān)的基因進(jìn)行加權(quán)基因相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）（19），作者以特定于細(xì)胞類型的方式擴(kuò)展了作者的分析主慰。作者確定了幾種模塊化的表達(dá)模式（圖2D和表S8）嚣州。在COVID-19組中鲫售，NFKB1 / 2共螺，JUN和TNF在CD8 + T和NK細(xì)胞（圖2D中的G6和G7 ）中被模塊化，而IL1B情竹，NFKBID和OSM在所有類型的單核細(xì)胞和DC中被模塊化藐不。 （圖2D中的G3 ）。在流感組中秦效，GBP1雏蛮，TAP1，STAT1阱州，IFITM3挑秉，OAS1，IRF3和IFNG在所有類型的T細(xì)胞和NK細(xì)胞（圖2D中的G2 ）中被模塊化苔货，而CXCL10和TLR4在所有類型的單核細(xì)胞和DC中被模塊化（G5和G6的一部分圖2D）犀概。一致地立哑，COVID-19和流感之間的DEG在CD8 + T細(xì)胞和所有類型的單核細(xì)胞中占主導(dǎo)地位（圖S2B）。
CD8 + T細(xì)胞在COVID-19和流感中的不同亞群
為了揭示CD8 + T細(xì)胞中疾病特異性的轉(zhuǎn)錄特征姻灶，作者使用Seurat對EM樣和非EM樣CD8 + T細(xì)胞簇進(jìn)行了亞群分析（17）铛绰。在非EM樣CD8 + T細(xì)胞簇中鑒定出與其他兩個(gè)組相比，每個(gè)疾病組專門富集的亞類（圖3A）产喉。在非EM樣CD8 + T細(xì)胞簇的六個(gè)亞簇中捂掰，簇1和簇3分別顯著富集了流感和COVID-19組（圖3，B和C曾沈，以及圖S3A）这嚣。PPBP高表達(dá)的簇在隨后的分析中排除了血小板的標(biāo)志物，即血小板的標(biāo)志物（例如晦譬，圖S3A中的簇6）疤苹。聚類1和聚類3中上調(diào)的基因分別與先前定義的“甲型流感病毒感染”和“ SARS-CoV感染”的基因集相關(guān)（圖S3B）（20）。作者還發(fā)現(xiàn)敛腌，簇3特異性上調(diào)的基因反映了免疫應(yīng)答的激活卧土，包括CD27，RGS1像樊，CCL5尤莺，SELL和RGS10（圖S3C和表S9）。根據(jù)STRING v11（21）在每個(gè)簇中選擇的前30個(gè)上調(diào)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析揭示了PRF1生棍，GNLY颤霎，群集1中的GZMB和GZMH以及群集3中的GZMK，GZMA涂滴，CXCR3和CCL5上調(diào)（圖3D友酱，綠色）。STAT1柔纵，TAP1缔杉，PSMB9，和PSME2搁料，這是通過IFN-γ優(yōu)先上調(diào)或详，過表達(dá)僅在流感特異性簇1（圖3D，藍(lán)色）郭计。作者通過細(xì)胞內(nèi)的顆粒酶B染色和佛波12-肉豆蔻酸13-乙酸鹽（PMA）/離子霉素刺激的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子對IFN-γ的染色驗(yàn)證了這些數(shù)據(jù)霸琴。CD8中顆粒酶B +和IFN-γ +細(xì)胞的百分比流感組的+ T細(xì)胞顯著高于COVID-19組（圖S3D）。在促炎和IFN反應(yīng)的7種代表性GO生物學(xué)途徑中昭伸，對IFN-I和IFN-II的反應(yīng)途徑與流感特異性簇1相關(guān)性更高梧乘，而對TNF或IL-1β的反應(yīng)途徑在流感中更為突出。特定于COVID-19的群集3（圖3E）庐杨。
圖3. CD8 ****+**** T細(xì)胞的亞群分析选调。
（A）所有組中非EM樣CD8 + T細(xì)胞亞群的tSNE圖（左嗡善，n = 6253），COVID-19（右上学歧，n = 2653）罩引，F(xiàn)LU（右中，n = 1452）枝笨，和HD（右下角袁铐，n = 2148）由群集信息著色。
（B和C）方框圖顯示了每個(gè)組中非EM樣CD8 + T細(xì)胞簇中各個(gè)亞簇的比例（COVID-19横浑，n = 10剔桨； FLU，n = 5徙融； HD洒缀，n = 4）。比例遵循Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)所檢驗(yàn)的正態(tài)分布欺冀，但COVID-19組中第3類的比例（P = 0.04）树绩。簇1和簇3分別在FLU和COVID-19組中高度富集。群集1中COVID-19和FLU之間的雙面Welch t檢驗(yàn)P值為4.4×10 -3隐轩，群集1中FLU和HD供體之間的雙邊Welch t檢驗(yàn)P值為3.5×10 -2饺饭，COVID-19和FLU之間為8.6×10 -3聚類3，以及聚類3中COVID-19和HD之間的5.8×10 -3职车。* P <0.05和** P <0.01瘫俊。
（D）使用聚類1（左）和聚類3（右）的前30個(gè)上調(diào)基因進(jìn)行STRING分析。
（E）條形圖顯示富集P簇1或簇3特異性上調(diào)基因中8種典型的促炎和干擾素GO生物學(xué)途徑的值（簇1悴灵，n = 66扛芽；簇3，n = 183）积瞒。
COVID-19中經(jīng)典單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征
作者對所有三種類型的單核細(xì)胞簇進(jìn)行了亞簇分析川尖，以發(fā)現(xiàn)COVID-19特異的亞簇。但是赡鲜，沒有特定于COVID-19的富集子簇（圖S4空厌，A和B）庐船。接下來银酬，作者進(jìn)一步關(guān)注經(jīng)典單核細(xì)胞，考慮其在炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用筐钟。作者研究了流行性感冒和COVID-19之間的DEG揩瞪，以尋找經(jīng)典單核細(xì)胞中COVID-19特異性的轉(zhuǎn)錄特征（圖4A）。TNF和IL1B是炎癥反應(yīng)的主要基因篓冲，分別被鑒定為COVID-19特異性基因和通常被上調(diào)的基因李破。為了更好地表征經(jīng)典單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征宠哄，作者進(jìn)行了K-與健康供體組相比，至少一個(gè)疾病組中上調(diào)基因的平均聚類嗤攻。作者確定了五個(gè)不同的上調(diào)簇（圖4B和表S10）：簇1中的基因在所有疾病組中通常都被上調(diào)毛嫉，簇2是流感特異性的，簇3與輕度/重度COVID-19相關(guān)妇菱，聚類4與流感和嚴(yán)重的COVID-19相關(guān)承粤，聚類5與嚴(yán)重的COVID-19相關(guān)。
圖4. COVID-19患者經(jīng)典單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組闯团。
（A）與HD相比辛臊，COVID-19和FLU中DEG的維恩圖。
（B）K均值表示所有對FLU房交，輕度COVID-19和重度COVID-19之間的DEG聚類（n = 499）彻舰。顏色表示疾病和HD之間的相對基因表達(dá)。
（C）條形圖顯示了富集分析中的平均-log 10（P值）值候味，使用L1000 LINCS中列出的四個(gè)不同細(xì)胞系的擾動(dòng)基因?qū)Υ?（C2刃唤，左）和簇3（C3）上調(diào)的基因。誤差線表示SD白群。
（D）比較了C2和C3之間I型IFN應(yīng)答（左透揣； GSE26104）和TNF應(yīng)答（右； GSE2638和GSE2639）的基因集的組合富集得分川抡。** P＜0.01辐真。每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)人。
（E）條形圖顯示了富集分析中的平均-log 10（P值）值崖堤，使用在L1000 LINCS中四個(gè)不同細(xì)胞系列出的擾動(dòng)基因侍咱，對簇4（C4，左）和簇5（ C5密幔，對）楔脯。誤差線表示SD（C和E）。
作者使用來自每個(gè)細(xì)胞因子處理過的細(xì)胞的細(xì)胞因子反應(yīng)性基因組胯甩，通過基因集富集分析（GSEA）檢查了每個(gè)簇特異性基因（Enrichr中的LINCS L1000配體擾動(dòng)分析）（22）昧廷。TNF /IL-1β反應(yīng)性基因富集于COVID-19特異性簇3基因，而TNF /IL-1β反應(yīng)性基因則富含IFN-I響應(yīng)基因使流感特異性簇2基因富集（圖4C）偎箫，表明與COVID-19相比木柬，IFN-I反應(yīng)在流感中占主導(dǎo)地位。作者通過分析源自其他來源的細(xì)胞因子反應(yīng)性基因組的簇特異性基因淹办，證實(shí)了這一結(jié)果（圖4D）眉枕。出乎意料的是，除了TNF /IL-1β反應(yīng)性基因外，第4和第5個(gè)簇還顯示出與IFN-I反應(yīng)性基因的強(qiáng)相關(guān)性（圖4E）速挑，這表明嚴(yán)重的COVID-19除了具有IFN-I反應(yīng)性特征外TNF /IL-1β-炎癥特征谤牡。
在嚴(yán)重COVID-19中，除了TNF /IL-1β炎癥反應(yīng)外姥宝，IFN-I反應(yīng)
接下來翅萤，作者直接比較了輕度和重度COVID-19之間的經(jīng)典單核細(xì)胞。當(dāng)作者分析DEG時(shí)腊满，嚴(yán)重COVID-19的特征是包括ISG15断序，IFITM1/2/3和ISG20在內(nèi)的各種ISG的上調(diào)（圖5A）。TNF /IL-1β反應(yīng)性基因和IFN-I反應(yīng)性基因均富含嚴(yán)重COVID-19特異性上調(diào)的基因（圖5B））糜烹。作者在COVID-19的較大人群中測量了TNF违诗，IL-1β，IL-6疮蹦，IFN-β诸迟，IFN-γ和IL-18的血漿濃度。在這些細(xì)胞因子中愕乎，重度COVID-19的IL-6和IL-18與輕度COVID-19相比顯著增加阵苇，而兩組之間其他細(xì)胞因子的血漿濃度沒有差異（圖S5A）。這些結(jié)果表明感论，由于細(xì)胞因子的重疊作用绅项，不能用幾種細(xì)胞因子簡單地解釋細(xì)胞因子反應(yīng)性基因簽名。
**圖5. ** 經(jīng)典單核細(xì)胞的軌跡分析
（A）火山圖顯示了輕度和重度COVID-19組之間的DEG比肄。每個(gè)點(diǎn)表示單個(gè)基因快耿，當(dāng)一個(gè)基因具有顯著的DEG時(shí)用紅色標(biāo)記。
（B）柱狀圖芳绩，顯示了使用嚴(yán)重1000 COVID-19組中上調(diào)的基因在L1000 LINCS中列出的四種不同細(xì)胞系的干擾基因在富集分析中的平均-log 10（P值）值住拭。誤差線表示SD镊屎。
（C）在單個(gè)COVID-19患者中在兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)獲得的標(biāo)本中經(jīng)典單核細(xì)胞的軌跡分析（輕度：C7-2逛尚，1,197個(gè)細(xì)胞鹏倘；重度：C7-1，631個(gè)細(xì)胞）嘹害。顏色表示群集信息（左）或COVID-19的嚴(yán)重性（右）撮竿。
（D）沿著偽時(shí)間繪制軌跡分析中代表性基因的相對表達(dá)模式。顏色表示由Monocle 2計(jì)算的相對基因表達(dá)笔呀。
（E）條形圖顯示了富集分析中的平均-log 10（P值）值幢踏，使用L1000 LINCS中四種不同細(xì)胞系的擾動(dòng)基因進(jìn)行了上調(diào)基因的表達(dá)。聚類3（左）和聚類1（右）凿可。誤差線表示SD惑折。
（F）比較系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）（n = 16）和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）（n = 5）的基因組在第3組和第1組之間的綜合富集得分。*** P <0.001枯跑；ns惨驶，不重要。
（G）Park等人在第3類（左）和第1類（右）中對單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞的1類基因模塊上調(diào)基因的GSEA 敛助。（24）粗卜。NES，標(biāo)準(zhǔn)化富集得分纳击。
為了進(jìn)一步研究嚴(yán)重COVID-19的特征续扔，作者使用兩個(gè)內(nèi)部控制良好的標(biāo)本（一個(gè)嚴(yán)重而一個(gè)輕度）對Monocle 2（23）進(jìn)行了軌跡分析，其中兩個(gè)PBMC樣本均從單個(gè)患者（個(gè)體C7）和COVID-19焕数。軌跡分析使經(jīng)典單核細(xì)胞沿著疾病嚴(yán)重性與分別對應(yīng)于較晚和較早的偽時(shí)間的聚類1和聚類3對齊（圖5C）纱昧。簇1中的代表性基因在嚴(yán)重階段富集，并且與IFN-I和TNF /IL-1β相關(guān)的炎癥反應(yīng)高度相關(guān)（圖5D）堡赔， 圖识脆。S5B和表S11）。GSEA證實(shí)善已，IFN-I應(yīng)答和TNF /IL-1β炎性應(yīng)答在簇1中均顯著灼捂，而在簇3中則不明顯（圖5E）。聚類1與來自系統(tǒng)性紅斑狼瘡的基因組相比具有顯著更高的關(guān)聯(lián)换团，系統(tǒng)性紅斑狼瘡是具有IFN-I特征的代表性炎性疾病悉稠，比聚類3更顯著（圖5F，左）艘包，但與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的基因組沒有顯著相關(guān)（圖5F的猛，右）。
通過分析對IFN-I無反應(yīng)但與TNF誘導(dǎo)的對TLR刺激的耐受性相關(guān)的基因模塊想虎，作者獲得了嚴(yán)重COVID-19中IFN-I增強(qiáng)的TNF炎癥反應(yīng)的其他證據(jù)衰絮。Park等。（24）先前證明TNF耐受單核細(xì)胞中TLR誘導(dǎo)的基因表達(dá)磷醋，盡管TNF本身是炎癥細(xì)胞因子猫牡。他們還表明，IFN-I通過消除TNF的耐受性效應(yīng)誘導(dǎo)高炎癥反應(yīng)邓线，并將負(fù)責(zé)IFN-I增強(qiáng)的TNF-核因子κB（NF-κB）炎癥反應(yīng)的基因模塊定義為“ 1類”（24）淌友。該基因模塊在簇1中顯著富集，但在簇3中卻沒有富集（圖5G）骇陈。）震庭，這表明IFN-I反應(yīng)可能會(huì)通過消除負(fù)面反饋機(jī)制來加劇炎癥過度。
致命病例中肺組織中高炎癥特征與IFN-I反應(yīng)的結(jié)合
最后你雌，作者使用從致命COVID-19患者的死后肺組織獲得的大量RNA-seq數(shù)據(jù)驗(yàn)證了IFN-I反應(yīng)和炎性特征（25）器联。盡管分析僅限于兩名沒有單個(gè)細(xì)胞類型分辨率的患者二汛，但在基因組瀏覽器中，死后COVID-19肺組織和經(jīng)典單核細(xì)胞中普遍觀察到IFITM1拨拓，ISG15和JAK3的上調(diào)以及RPS18的下調(diào)肴颊。嚴(yán)重的COVID-19（圖6A）。在細(xì)胞因子反應(yīng)基因組的分析中渣磷，肺組織中IFN-I反應(yīng)和TNF /IL-1β-炎癥反應(yīng)均顯著（圖6B））婿着。肺組織中的DEG與簇4顯著相關(guān)，簇4在流感和嚴(yán)重COVID-19中通常上調(diào)醋界，而簇5在圖4B中對特異COVID-19具有特異性（圖6C）竟宋。這些基因也與軌跡分析中鑒定的聚類1顯著相關(guān)，但與聚類3不相關(guān)（圖6D）形纺。當(dāng)基因組由輕度和重度COVID-19之間的DEG定義時(shí)丘侠，死后肺組織中的DEG與在重度COVID-19中特異上調(diào)的基因顯著相關(guān)（圖6E）。
圖6： 來自致命COVID-19的死后肺組織轉(zhuǎn)錄組中組合的IFN-I和炎癥反應(yīng)的驗(yàn)證逐样。
（A）UCSC基因組瀏覽器代表基因的圖片婉陷。
（B）條形圖顯示了使用L1000 LINCS中四種不同細(xì)胞系的擾動(dòng)基因進(jìn)行的富集分析的平均值-log 10（P值）值，與活檢健康人相比官研，死后肺組織中的上調(diào)基因（n = 386）肺組織秽澳。誤差線表示SD。
（C）死后肺組織中基因集的顯著上調(diào)和下調(diào)基因的GSEA來自C2（n = 96）戏羽，C3（n = 143）担神，C4（n = 218）和C5的上調(diào)基因圖4B的（n＝ 30）。
（D和E）GSEA的死后肺組織用于基因組顯著上調(diào)和下調(diào)的基因起源于簇3中的頂部200上調(diào)基因（左）和在軌跡分析簇1（右）圖5C（ D）和基因集源自輕度（左）和重度（右）COVID-19（E）的經(jīng)典單核細(xì)胞中前200個(gè)上調(diào)的基因始花。
嚴(yán)重的COVID-19已被證明是由炎癥反應(yīng)引起的（7）妄讯。特別是，經(jīng)典單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子被認(rèn)為在COVID-19的嚴(yán)重進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用（26）酷宵。在目前的研究中亥贸，作者證實(shí)了先前研究的結(jié)果，盡管TNF /IL-1β炎性反應(yīng)在COVID-19中占主導(dǎo)地位浇垦，盡管有少數(shù)患者入選炕置。但是，作者還發(fā)現(xiàn)男韧，嚴(yán)重的COVID-19除TNF /IL-1β反應(yīng)外還伴有IFN-I反應(yīng)朴摊。這些結(jié)果表明，在嚴(yán)重的COVID-19進(jìn)展中此虑，IFN-I反應(yīng)可能通過增強(qiáng)TNF /IL-1β驅(qū)動(dòng)的炎癥來促進(jìn)炎癥反應(yīng)甚纲。
數(shù)據(jù)上傳至 GEO GSE149689.
參考：
1.導(dǎo)讀： http://www.ebiotrade.com/newsf/2020-7/2020714172546874.htm
2.Immunophenotyping of COVID-19 and influenza highlights the role of type I interferons in development of severe COVID-19.
