BACKGROUND
新冠病毒（SARS-CoV-2）屬于冠狀病毒科，具有較強(qiáng)的傳染性和低致死性拯腮。截止2020年10月，引起的新冠肺炎（COVID-19）病例數(shù)已達(dá)4000萬(wàn)动壤，死亡人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)。過(guò)去20年琼懊，已經(jīng)出現(xiàn)了三個(gè)人獸共患的冠狀病毒：SARS-CoV (2002) ，MERS-CoV (2012)?哼丈，SARS-CoV-2（2019）。鑒于SARS-CoV-2已經(jīng)在全球范圍內(nèi)對(duì)人的生命和經(jīng)濟(jì)造成重大損失削祈，許多研究機(jī)構(gòu)脑漫、政府和藥企已經(jīng)致力于開(kāi)發(fā)抗病毒藥物和疫苗咙崎。目前优幸，近30種抵抗SARS-CoV-2的疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)中褪猛；美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的瑞德西韋用于新冠肺炎治療，作為SARS-CoV-2的RNA依賴(lài)RNA聚合酶抑制劑伊滋。目前新冠肺炎的治療主要針對(duì)病毒本身，本研究提供了宿主基因如何影響病毒進(jìn)入笑旺，并為治療提供新的途徑，有望加速易感人群的康復(fù)筒主。
RESULTS
1、高通量篩選鑒定SARS-CoV-2感染必須基因
研究者使用人的GeCKOv2文庫(kù)病毒（~0.2 MOI）感染A549ACE2細(xì)胞乌妙，嘌呤霉素藥篩9天，隨后0.3和0.01 MOI SARS-CoV-2分別感染巴細(xì)胞藤韵，感染24h檢測(cè)核衣殼（N）蛋白表達(dá)，感染6天后存活的細(xì)胞被提取DNA用于高通量測(cè)序泽艘。研究者用3種方法（Robust rankaggregation，RIGER weighted-sum and second-best rank）鑒定的富集基因高度重疊悉盆。在低劑量和高劑量組的TOP 50中，有27個(gè)相同的基因秋秤。
Fig1. 文庫(kù)篩選寄NGS
2、富集基因參與病毒生命周期的多個(gè)方面且廣泛表達(dá)
富集的基因分別參與病毒的吸附灼卢，內(nèi)吞来农，纖突蛋白裂解和病毒膜融合鞋真，ER-Golgi運(yùn)輸沃于，轉(zhuǎn)錄調(diào)控海诲，聚集在少數(shù)蛋白復(fù)合物中，包括空泡ATP酶特幔、逆轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（Retromer）、Commander蚯斯、Arp2/3和PI3K。
Fig2. Top-Ranked 基因參與病毒的生命周期
為了探索是否宿主基因丟失降低SARS-CoV-2 感染是肺組織特異性或者更廣泛的表達(dá)拍嵌，作者選取TOP Rank基因檢測(cè)他們?cè)?2個(gè)組織中的表達(dá)循诉，結(jié)果表明候選基因均在組織中廣泛表達(dá)（Fig 3C）横辆。
3茄猫、富集的基因參與病毒蛋白互作，也參與其他病毒的感染
Gordon et al. 分別表達(dá)帶標(biāo)簽的SARS-CoV-2 蛋白募疮，瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞后僻弹，pull down與宿主互作的蛋白阿浓，質(zhì)譜鑒定出與病毒蛋白互作的332宿主蛋白蹋绽。在CRISPR篩選中，部分排名靠前的蛋白也被報(bào)道與病毒蛋白互作（Fig 3D）卸耘，如ATP6AP1 ，ATP6V1A 分別與nsp6蚣抗，M蛋白互作。ATP6AP1在低MOI和高M(jìn)OI組中分別排名第2和第4翰铡；RAB7A 與nsp7互作，文庫(kù)篩選位于TOP 50锭魔。Samavarchi-Tehrani et al. 研究A549細(xì)胞中與SARS-CoV-2蛋白互作的宿主蛋白有22個(gè)與低MOI CRISPR 篩選的TOP 50一致。
有趣的是迷捧，SARS-CoV-2 和ZIKV感染的CRISPR細(xì)胞胀葱，篩選宿主基因在GO富集基因類(lèi)別有更大的相似性笙蒙。SARS-CoV-2 篩選的TOP 50基因中，若干宿主基因在流感病毒手趣、ZIKV病毒感染中也顯著富集，其中包含囊泡ATP酶質(zhì)子泵（參與酸化和內(nèi)體加工）绿渣。
Fig3. 富集基因參與的信號(hào)通路、組織表達(dá)情況中符，與病毒蛋白互作，也參與其他病毒的發(fā)病機(jī)制
4淀散、CRSPR Knockout,RNA干擾，小分子抑制劑驗(yàn)證富集基因
為了驗(yàn)證TOP-ranked基因阻斷SARS-CoV-2病毒感染档插，研究者挑選30個(gè)基因，分別構(gòu)建KO細(xì)胞株郭膛，隨后用0.1 MOI SARS CoV-2感染細(xì)胞（Cas9-perturbed A549ACE2 ），感染36h则剃，免疫熒光檢測(cè)SARS CoV-2 N蛋白，結(jié)果表明每組感染的KO細(xì)胞降低了10倍棍现。
囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)基因如RAB7A,?CCDC22, 和 VPS35，其他基因如 ACE2 士袄，CTSL 敲除后，顯著降低了SARS CoV-2病毒感染窖剑、病毒載量。在人的肝細(xì)胞Huh7.5ACE2 也觀察到類(lèi)似的結(jié)果西土。siRNA 分別抑制靶基因，SARS-CoV-2 感染的細(xì)胞也顯著下降需了。
CRISPR 篩選的TOP-ranked基因跳昼，結(jié)合藥物-基因作用數(shù)據(jù)庫(kù)（DGIdb數(shù)據(jù)庫(kù)）篩選出69個(gè)制藥基因肋乍，研究者篩選了9個(gè)基因，是26個(gè)小分子抑制劑的主要或次要靶點(diǎn)（Fig.4 E）墓造。其中有9個(gè)藥物是FDA批準(zhǔn)的，7個(gè)是不同疾病的2期和3期臨床實(shí)驗(yàn)觅闽。小分子抑制劑和瑞德西韋中，PIK-III, Compound-19, SAR405, autophinib, ALLN, tamoxifen, and ilomastat 顯著抑制了病毒的感染,病毒載量降低100倍蛉拙；靶向PIK3C3 的4個(gè)抑制劑、autophinib和ALLN 組病毒載量降低1000倍孕锄。
Fig. 4 單基因驗(yàn)證及藥物靶標(biāo)篩選
5、單細(xì)胞測(cè)序鑒定膽固醇合成作為多個(gè)富集基因的調(diào)控機(jī)制
為了更好的理解每個(gè)基因KO后如何影響SARS-CoV-2感染和宿主基因缺失改變轉(zhuǎn)錄進(jìn)程宦芦，研究者利用ECCITE-seq鑒定分子機(jī)制和抵抗病毒感染的細(xì)胞通路；研究者發(fā)現(xiàn)ATP6AP1, ATP6V1A,CCDC22, NPC1, PIK3C3,和RAB7A基因Knockout,產(chǎn)生相似的上調(diào)差異表達(dá)基因踪旷，并且導(dǎo)致脂質(zhì)和膽固醇生物合成途徑上調(diào)，這6個(gè)基因的功能缺失突變可能通過(guò)類(lèi)似的機(jī)制發(fā)揮作用，即抵抗病毒介導(dǎo)的膽固醇合成機(jī)制舀患。差異表達(dá)的基因中，有61個(gè)和CRISPR 篩選重疊聊浅，如在6個(gè)靶基因Knockout細(xì)胞中，膽固醇表達(dá)量顯著上調(diào)低匙。利用這一見(jiàn)解，作者研究了氨氯地平（amlodipine）的影響顽冶，氨氯地平處理的細(xì)胞中，病毒感染細(xì)胞數(shù)强重、核衣殼mRNA镊叁，噬斑形成顯著降低；amlodipine處理細(xì)胞的RNA-seq顯示的差異表達(dá)基因和ECCITE-seq相似艺智，其中膽固醇生物合成途徑上調(diào)。
Fig.5 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組
6十拣、RAB7A Knockout降低細(xì)胞表面表達(dá)ACE2， 增加內(nèi)體累積ACE2
Rab7a 是一個(gè)小的GTP酶夭问，調(diào)控囊泡運(yùn)輸和膜轉(zhuǎn)運(yùn)。RAB7A Knockout細(xì)胞表面ACE2表達(dá)顯著降低甲喝。共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，RAB7A Knockout導(dǎo)致ACE2累積在胞漿和內(nèi)體埠胖，少部分位于溶酶體。
Fig.6 RAB7A Knockout降低細(xì)胞表面表達(dá)ACE2直撤， 增加內(nèi)體累積ACE2
綜上所述蜕着，該研究可能為開(kāi)發(fā)有效治療COVID-19的新型藥物提供了重要見(jiàn)解谋竖，并揭示它們的分子靶點(diǎn)承匣，有望加速易感人群的康復(fù)。
參考文獻(xiàn)：
1.Zharko Daniloski?et al. Identification of required host factors for SARS-CoV-2 infection in human cells. Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.10.030.
