作者：馬可菠蘿
編輯：amethyst

引言

植物中單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的大規(guī)模研究受限于原生質(zhì)體的制備炎疆。本研究提出了一種無需制備原生質(zhì)體的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組建庫測序方法逗爹，flsnRNA-seq∽⒁妫基于10x Genomics和Nanopore平臺實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞水平上檢測細(xì)胞核中全長轉(zhuǎn)錄本的突破带斑。

一、背景簡介

近年來班缰，動物和人類中高通量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究如火如荼。然而悼枢，只有少量的研究使用10x Genomics或Drop-seq平臺來開展高通量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究埠忘。造成這種困境的主要原因是，植物細(xì)胞有細(xì)胞壁包裹萧芙，需要剝離細(xì)胞壁來釋放單個細(xì)胞给梅，但是破壁提取完整的原生質(zhì)體較為困難假丧，不同組織的處理方法也不盡相同双揪。

此外，考慮到植物組織的復(fù)雜性包帚，從所有細(xì)胞均勻的獲取原生質(zhì)體具有挑戰(zhàn)性渔期，而原生質(zhì)體分離過程中的酶消化和隨后的處理過程可能會觸發(fā)應(yīng)激反應(yīng)從而影響轉(zhuǎn)錄組。

因此渴邦，一種無需原生質(zhì)體制備的方法急需出現(xiàn)來打破上述壁壘疯趟。

二、文庫構(gòu)建

由于植物組織的細(xì)胞核的制備比較容易谋梭，使用10x Genomics平臺對細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄本信息進(jìn)行測序并進(jìn)行細(xì)胞身份識別信峻。為了評估數(shù)目眾多的含有內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄本，同時進(jìn)行了基于Nanopore 的文庫構(gòu)建和測序瓮床，并開發(fā)了一套生物信息分析流程（snuupy）（下圖）盹舞。

圖1. flsnRNA-seq建庫測序分析示意圖

細(xì)胞核進(jìn)入10x Genomics Chromium平臺产镐，獲得帶有核特異條形碼標(biāo)記的全長cDNA模板，然后將其分成兩等份踢步，分別用于構(gòu)建Illumina短讀長文庫和Nanopore長讀長文庫癣亚，并分別進(jìn)行生物信息分析。

三获印、結(jié)果與討論

本研究對擬南芥的根和胚乳分別進(jìn)行了建庫測序述雾。由于擬南芥關(guān)于根的研究比較多，且有較多的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)支持兼丰，首先基于擬南芥根組織的數(shù)據(jù)來驗證flsnRNA-seq的有效性玻孟。

Illumina文庫測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出了1186個單細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，覆蓋了18,913個基因地粪，細(xì)胞核中基因數(shù)目的中值為810取募，細(xì)胞核中UMI數(shù)目的中值為1131。值得注意的是蟆技，細(xì)胞核中含有內(nèi)含子的mRNA數(shù)目遠(yuǎn)高于總RNA（前人數(shù)據(jù)）中的數(shù)目（下圖）玩敏。

圖2. 轉(zhuǎn)錄本類型比例

通過Illumina數(shù)據(jù)得到的表達(dá)矩陣和聚類分析顯示，細(xì)胞核數(shù)據(jù)鑒定出了14個不同的細(xì)胞簇（下圖）质礼，并根據(jù)擬南芥根細(xì)胞類型標(biāo)記基因進(jìn)行了注釋旺聚，鑒定出了10個前人報道的細(xì)胞類型。與前人研究結(jié)果相似眶蕉，本研究中的一些細(xì)胞類型是由多個簇組成的砰粹，如。如干細(xì)胞巢(cluster1造挽、4和12)碱璃，內(nèi)皮層(cluster5和cluster8)，暗示出細(xì)胞類型之外的異質(zhì)性饭入。

圖3. 細(xì)胞聚類

此外嵌器，本研究使用Scanorama 算法將 flsnRNA-seq數(shù)據(jù)與近期發(fā)表的擬南芥根組織原生質(zhì)體單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)表達(dá)豐度矩陣極其相似（下圖）谐丢。

圖4. 比對打分熱圖

Heatmap表示由本研究生成的細(xì)胞核數(shù)據(jù)和前人發(fā)表的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集之間的比對評分爽航。比對評分使用Scanorama計算。得分越高乾忱，說明一對數(shù)據(jù)集之間的相似度越高讥珍。

總之，上述研究表明flsnRNA-seq轉(zhuǎn)錄組足以進(jìn)行細(xì)胞類型鑒定分析窄瘟，并且可以作為原生質(zhì)體的可靠替代品衷佃。

對于Nanopore數(shù)據(jù)，一個關(guān)鍵的問題是測序準(zhǔn)確性偏低蹄葱，使得正確識別細(xì)胞barcode和UMI序列變得困難氏义。為了解決該問題衰腌，本研究基于Sicelore算法開發(fā)出snuupy來檢索barcode和UMI序列（下圖）。

圖5. Sicelore和snuupy算法的對比

最終觅赊，Nanopore 數(shù)據(jù)分析得到了1169 個細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組右蕊，且Nanopore與Illumina的數(shù)據(jù)檢出UMI、Gene的重疊性較高（下圖）吮螺。

圖6. Nanopore和Illumina分配數(shù)據(jù)的重疊性

另外饶囚，Nanopore文庫數(shù)據(jù)細(xì)胞聚類結(jié)果和Illumina文庫數(shù)據(jù)的聚類結(jié)果很相似（下圖）

圖7. Nanopore細(xì)胞核數(shù)據(jù)聚類

這表明Nanopore數(shù)據(jù)本身就足以對細(xì)胞類型進(jìn)行分類，這與最近一項完全利用納米孔數(shù)據(jù)對人類和小鼠細(xì)胞進(jìn)行的大規(guī)模單細(xì)胞分析一致鸠补。

此外萝风，Nanopore數(shù)據(jù)還可以提供轉(zhuǎn)錄本水平的信息，如：剪切和多聚腺苷酸化（APA）紫岩，因此本研究額外生成兩個轉(zhuǎn)錄本矩陣來研究剪切和APA规惰。將上述矩陣對Illumina數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行整合，以探究是否會提升細(xì)胞分型的準(zhǔn)確性泉蝌。

事實(shí)上歇万，經(jīng)過多層聚類后，原始的Illumina聚類結(jié)果中的cluster10（皮質(zhì)）能夠被分為2個亞細(xì)胞類型簇（下圖）勋陪。

圖8. 多層矩陣模式圖

以基因AT3G19010為例：Illumina的數(shù)據(jù)中贪磺，轉(zhuǎn)錄本AT3G19010存在于2.1和2.2型亞細(xì)胞中，Nanopore數(shù)據(jù)顯示诅愚，這兩個亞簇在剪接水平上存在很大的差異寒锚，在亞細(xì)胞類型2.2中，第二個內(nèi)含子基本未剪接（下圖）违孝。

圖9. AT3G19010基因Illumina和Nanopore比對reads

至此刹前，flsnRNA-seq的可靠性已經(jīng)經(jīng)過了驗證，后續(xù)需要對其他類型的組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究雌桑。

在開花植物中喇喉，種子發(fā)育是從雙受精開始的，在此過程中卵細(xì)胞和中心細(xì)胞分別與精子細(xì)胞融合形成胚胎和胚乳筹燕。胚乳嵌在種皮中轧飞，負(fù)責(zé)向發(fā)育中的胚胎提供營養(yǎng)衅鹿。擬南芥的胚乳中撒踪，受精后形成的原核經(jīng)過幾輪快速核分裂而沒有胞質(zhì)分裂，形成一個多核細(xì)胞大渤，稱為合胞體制妄。合胞體細(xì)胞化并分化為三個胚乳域：珠孔、中央外周和合點(diǎn)（下圖泵三，右）耕捞。

對胚乳組織并進(jìn)行單細(xì)胞核提取建庫和測序衔掸，基于Illumina數(shù)據(jù)鑒定出了6個cluster（下圖，左）俺抽。

圖10. 胚乳單細(xì)胞聚類和細(xì)胞分布模式圖

隨后使用Nanopore單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)來分析每個細(xì)胞核中的外顯子滯留情況敞映，結(jié)果顯示cluster4（含有總細(xì)胞核的 14%）含有較高比例的不完全剪切轉(zhuǎn)錄本。在這一特定的胚乳核簇中磷斧，這可能反映了mRNA前體的延遲衰變振愿、內(nèi)含子轉(zhuǎn)換率中斷或轉(zhuǎn)錄的全局激活。

圖11. 各cluster中不完全剪切比例（one-sided Kolmogorov-Smirnov test）

使用前人報道的細(xì)胞類型富集基因來分配細(xì)胞弛饭，結(jié)果顯示cluster4中的大部分細(xì)胞被注釋為珠孔的胚乳（下圖）冕末。

圖12. 各cluster中每個細(xì)胞類型的細(xì)胞核定量

cluster4中上調(diào)表達(dá)基因的Gene Ontology （GO）分析顯示，全部富集術(shù)語條目的功能均與膜相關(guān)侣颂，這些細(xì)胞可能與細(xì)胞膜生成有關(guān)档桃，與前人的報道一致，擬南芥胚乳的細(xì)胞化始于珠孔胚乳憔晒。

圖13. cluster4中上調(diào)基因GO分析

綜上藻肄，發(fā)現(xiàn)了一個獨(dú)特的具有高比例不完全剪接轉(zhuǎn)錄物的胚乳核簇，進(jìn)一步的研究可以確定這是由于轉(zhuǎn)錄的增加還是剪接延遲拒担。

四仅炊、總結(jié)

作為在植物中的概念驗證，本研究的結(jié)果表明澎蛛，在擬南芥中抚垄，無需原生質(zhì)體制備的大規(guī)模單核測序足以進(jìn)行細(xì)胞類型分類和標(biāo)記基因鑒定。

在10x Genomics平臺上使用分離核進(jìn)行單細(xì)胞測序的單個細(xì)胞成本仍然相對于原生質(zhì)體的成本較高谋逻，使用細(xì)胞核建庫捕獲率偏低呆馁，這可能是由于細(xì)胞核的尺寸更小，因此毁兆，仍有進(jìn)一步優(yōu)化的空間浙滤。取代原生質(zhì)體作為先決條件將使更多更復(fù)雜的組織和植物物種的大規(guī)模單細(xì)胞分析成為可能，然而气堕，從某些組織類型的細(xì)胞中分離細(xì)胞核仍然具有挑戰(zhàn)性纺腊，需要進(jìn)一步建立和優(yōu)化細(xì)胞核分離的方法。

本研究建立了一個整合納米孔的全長RNA測序方法和單核測序的方法茎芭，能夠在單核水平捕獲細(xì)胞亞型的多樣性揖膜，并可通過整合多層次的信息，來提升細(xì)胞類型分類的準(zhǔn)確性梅桩。

五壹粟、參考資料

1. Yanping Long et al. FlsnRNA-seq: protoplasting-free full-length single-nucleus RNA profiling in plants .2021. Genome Biology.
2. SNUUPY: https://github.com/ZhaiLab-SUSTech/snuupy