在2019年的三月份我正式開始做單細(xì)胞相關(guān)研究工作,有趣的同時也是朋友我們經(jīng)常誤會的是:你是不是用流式細(xì)胞術(shù)钧惧?而我在得知自己要做這單細(xì)胞(single cell )的研究時,在Google搜關(guān)鍵詞(single cell )勾习,居然有不少是介紹流式細(xì)胞術(shù)的。流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用到高通量測序領(lǐng)域就變成了微流控技術(shù)巧婶⊥课冢可見,把生命科學(xué)的視界拉倒單細(xì)胞水平的比高通量測序更早的是流式細(xì)胞術(shù)湾盒。
那么在單細(xì)胞測序技術(shù)出現(xiàn)之前,人們在研究單細(xì)胞的時候都是怎么做的呢诅妹,都有哪些分析點呢?單細(xì)胞測序技術(shù)給單細(xì)胞研究帶來了哪些新的視角吭狡?這一切的答案都要求我們對流式細(xì)胞術(shù)有一個基本的了解。
流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項能快速分衫、精確的對單個細(xì)胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)铐懊。
流式細(xì)胞儀是測量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強度的細(xì)胞分析儀茅茂,是在單個細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)(如大小令杈、內(nèi)部結(jié)構(gòu)跌榔、DNA纲刀、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等)進行快速測量并可分類收集的高技術(shù)。
采用激光作為激發(fā)光源墨坚,保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率柑船;利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)逆巍,保證檢測的靈敏度和特異性笙僚;用計算機系統(tǒng)對流動的單細(xì)胞懸液中單個細(xì)胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析檬嘀,保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。
(1) 液流系統(tǒng)
(2) 光學(xué)系統(tǒng)
(3) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
激光光源:氣冷式氬離子激光器
分色反光鏡:反射長/短波長,通過短/長波長
光束成形器:兩十字交叉放置的透鏡
透鏡組:形成平行光,除去室內(nèi)光
濾片:長通替久、短通颅拦、帶通
光電倍增管:FS, SS(散射光), FL1, FL2, FL3, FL4(熒光)
光散射測量最有效用途:從非均一群體中鑒別出某些亞群
測得的FS與SS信號通過計算機處理,可得到FS-SS圖,由此可僅用散射光信號對未染色的活細(xì)胞進行分析或分選分唾。此為血細(xì)胞分類的基本原理,但不能分析表面分子。
熒光信號由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生沙峻,發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。
每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色两芳,通過波長選擇通透性濾片,可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開怖辆,送入不同的光電倍增管。
選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細(xì)胞上的多個不同特征疗隶。
線性放大器和對數(shù)放大器
細(xì)胞分選
通過流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞分選主要是在對具有某種特征的細(xì)胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的佑笋。
- 分選速度:單位時間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量蒋纬。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。
- 分選純度:分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率坚弱。
- 分選收獲率:實際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過測量點的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比荒叶。
- 分選得率:從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量碾阁,再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實際得率些楣。與分選速度成反比。
FS:反映顆粒的大小
SS:反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度
FL:反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少
直分析方圖
單參數(shù)直方圖
雙參數(shù)直方圖:點圖
二維等高圖
假三維等高圖
三參數(shù)直方圖
多參數(shù)分析
設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置
雙參數(shù)直方圖:縱軸和橫軸分別代表被測量細(xì)胞的兩個測量參數(shù)愁茁,根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達位置。
雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號鹅很,最常用的是點密圖,在圖中促煮,每個點代表一個細(xì)胞邮屁,點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少菠齿。
由類似地圖上的等高線組成,其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖泞当。
等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對或絕對數(shù)民珍,即“等高”襟士。
曲線層次越高(越里面的線) 所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。
等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大陋桂。
- 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下,從分子水平上獲取多種信號實現(xiàn)對單個細(xì)胞進行定量分析或純化分選嗜历。
- FCM分析中前向散射光反映顆粒的大小梨州;側(cè)向散射光反映顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度痕囱、表面的光滑程度暴匠;熒光反映顆粒被染上熒光部分?jǐn)?shù)量的多少,根據(jù)其標(biāo)記的抗原分子不同每窖,即反映了不同抗原分子的表達情況帮掉。
- 同型對照為免疫熒光標(biāo)記中的陰性對照窒典,可使熒光標(biāo)記單抗的信號保持其特異性。
- 對各項工作環(huán)節(jié)和儀器性能進行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和規(guī)范化操作瀑志,是保證FCM分析中各項檢測數(shù)據(jù)和指標(biāo)可靠性的關(guān)鍵涩搓。
流式細(xì)胞儀(FCM)是集單克隆抗體劈猪、熒光化學(xué)、激光岸霹、計算機等高技術(shù)發(fā)展起來的一種先進儀器疾层,已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)贡避、生物化學(xué)、生物學(xué)刮吧、腫瘤學(xué)以及血液學(xué)等方面的研究和臨床常規(guī)工作湖饱。
①細(xì)胞生物學(xué):細(xì)胞凋亡研究杀捻;定量分析細(xì)胞周期并分選不同細(xì)胞周期時相的細(xì)胞;分析生物大分子如DNA、RNA仅仆、抗原、癌基因表達產(chǎn)物等物質(zhì)與細(xì)胞增殖周期的關(guān)系墓拜,進行染色體核型分析港柜,并可純化X或Y染色體咳榜。[詳細(xì)]
②腫瘤學(xué):DNA倍體含量測定是鑒別良、惡性腫瘤的特異指標(biāo)涌韩。近年來已應(yīng)用DNA倍體測定技術(shù),對白血病臣樱、淋巴瘤及肺癌靶擦、膀胱癌擎淤、前列腺癌等多種實體瘤細(xì)胞進行探測。用單克降抗體技術(shù)清除血液中的腫瘤細(xì)胞嘴拢。[詳細(xì)]
③免疫學(xué):研究細(xì)胞周期或DNA倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達的關(guān)系桩盲;進行免疫活性細(xì)胞的分型與純化席吴;分析淋巴細(xì)胞亞群與疾病的關(guān)系;免疫缺陷病如艾滋病的診斷孝冒;器官移植后的免疫學(xué)監(jiān)測等柬姚。[詳細(xì)]
④血液學(xué):血液細(xì)胞的分類庄涡、分型,造血細(xì)胞分化的研究穴店,血細(xì)胞中各種酶的定量分析撕捍,如過氧化物酶泣洞、非特異性酯酶等;用NBT及DNA雙染色法可研究白血病細(xì)胞分化成熟與細(xì)胞增殖周期變化的關(guān)系球凰,檢測母體血液中Rh(+)或抗D抗原陽性細(xì)胞狮腿,以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發(fā)生嚴(yán)重溶血;檢測血液中循環(huán)免疫復(fù)合物可以診斷自身免疫性疾病缘厢,如紅斑狼瘡等。[詳細(xì)]
⑤藥物學(xué):檢測藥物在細(xì)胞中的分布昧绣,研究藥的作用機制规肴,亦可用于篩選新藥夜畴,如化療藥物對腫瘤的凋亡機制,可通過測DNA凋亡峰删壮,Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等。[詳細(xì)]
細(xì)胞凋亡研究:細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因控制下的有序死亡央碟,在疾病發(fā)生税灌、發(fā)展中有重要作用亿虽,因而研究細(xì)胞凋亡有重要意義。細(xì)胞凋亡檢測方法很多洛勉,應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞在凋亡過程中發(fā)生一系列形態(tài)粘秆、生化變化從多個角度對細(xì)胞凋亡進行定性和定量的測定收毫。[詳細(xì)]
** 細(xì)胞分選**:流式細(xì)胞儀能夠分選某一亞群細(xì)胞,分選純度>95%。目前細(xì)胞分選主要用于研究此再,臨床應(yīng)用較少。利用流式細(xì)胞儀分選免疫擔(dān)當(dāng)細(xì)胞進行細(xì)胞免疫學(xué)研究也是目前的熱門課題输拇。流式細(xì)胞儀能夠分選出你想得到的任何一亞群細(xì)胞摘符,只要你想得到的某一亞群細(xì)胞有合適的單克隆抗體標(biāo)記策吠。[詳細(xì)]
** 細(xì)胞因子的檢測**:隨著多標(biāo)記及胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn),使對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的研究推向了一個新的階段奴曙。本文主要對胞內(nèi)細(xì)胞因子流式細(xì)胞技術(shù)作介紹别凹。[詳細(xì)]
** 血液學(xué)應(yīng)用**:本文向您介紹流式細(xì)胞儀在血液研究領(lǐng)域的應(yīng)用洽糟,包括DNA倍體分析及細(xì)胞周期分析堕战,淋巴細(xì)胞亞群測定,白血病免疫分型拍霜,淋巴瘤免疫分型,紅細(xì)胞疾病診斷祠饺,血小板功能分析和血小板病診斷越驻,微小殘留白血病檢測道偷,白細(xì)胞吞噬功能測定,NK和LAK細(xì)胞活性測定勺鸦,造血干/祖細(xì)胞測定等并巍。[詳細(xì)]