一信姓、實驗目的
細菌培養(yǎng)用于后續(xù)的細胞感染达吞、動物感染张弛、以及轉(zhuǎn)化、蛋白提取、質(zhì)粒提取等實驗吞鸭。
二寺董、實驗步驟(protocol)
(一)滅菌<必要的實驗前準備>
1.常用滅菌方法:
? ? ①干熱滅菌法:適用于玻璃材質(zhì)的器皿。用稱量紙與細菌培養(yǎng)的專用封口膜將試管口封住刻剥，于160℃滅菌2h遮咖；
? ?②高溫高壓滅菌法:適用于塑料材質(zhì)的器皿。在滅菌鍋中進行造虏，若對玻斑璃器皿進行滅菌盯滚，則會產(chǎn)生冷凝水，滅菌完畢后酗电，宜置于60°C烘箱烘干。滅菌鍋參數(shù):121℃内列，30min撵术。
2.需滅菌的器材:試管、培養(yǎng)皿话瞧、玻璃涂布棒嫩与、槍頭盒。
(二) LB培養(yǎng)基配制??
1.根據(jù)說明書配方配制LB培養(yǎng)基(液態(tài))與氨芐青霉素LB瓊脂培養(yǎng)平板(固態(tài)),注意 PH調(diào)節(jié)交排。
2.參考配方:將胰蛋白胨 10g划滋、酵母提取物5 g、NaCl 10g加入800mL去離水中埃篓，搖動容器直至溶質(zhì)溶解处坪，調(diào)PH至7.0，用去離子水定容至1000mL架专。高壓蒸汽滅菌同窘，冷凍保存(-20℃)備用。注意盛放液體培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)液面≤2/3（三分之二）
3.氨芐青霉素LB瓊脂培養(yǎng)平板的制備
將瓊脂粉1.5g加入100mL LB培養(yǎng)基中部脚，高壓滅菌想邦，振搖使瓶內(nèi)瓊脂完全溶解，冷至40~50°C后委刘，無菌條件下向并內(nèi)加入50mg/mL氨芐青霉素100μL丧没，超凈臺上將其倒入10mm的培養(yǎng)平皿中，一般倒15~20mL即可锡移，室溫下冷至瓊脂凝固呕童。
(三)菌種復蘇
? ? 拿到新的菌株時，注意鑒定是否含有雜菌淆珊，鑒定方法有：
? ? ①傳統(tǒng)方法：用接種環(huán)將菌涂在玻璃薄片上拉庵，然后鏡檢細菌型態(tài)，參照文獻記錄和或說明書進行比對判斷(菌液一定要稀釋后再涂布染色,避免菌太密集
? ? ②全新方法：涂布固體培養(yǎng)皿，判斷生長的是否是單一菌落钞支，若察覺異常茫蛹，則需要進行測序鑒定，挑一個單菌落烁挟，放在PBS或生理鹽水的緩沖液中婴洼，送到測序公司測序，檢定該菌是否是待培養(yǎng)的細菌撼嗓，若鑒定結(jié)果是待培養(yǎng)菌則可進行細菌的擴大培養(yǎng)柬采。
(四)細菌的擴大培養(yǎng)
1.細菌擴大培養(yǎng)可在液態(tài)培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中進行菌液的室溫融化即可。
2.單一菌落經(jīng)稀釋后放入液態(tài)培養(yǎng)基中,37℃恒溫搖床120rpm搖菌（一般1：1000比例加入氨芐青霉素）且警，不要過夜搖菌粉捻，可放在4℃冰箱保存。(細菌稀釋經(jīng)驗推薦：稀釋比例5%即| mL菌液加到20ml液態(tài)培養(yǎng)基)斑芜。
3.玻璃涂布捧在采菌時肩刃，先在酒精燈的火焰上燒一下，記住燒出的黑色物質(zhì)需要去除后方能使用杏头，然后把細菌用玻璃涂布捧涂在固態(tài)培養(yǎng)基上盈包，37°C孵箱倒置培養(yǎng)。
(五)細菌的凍存
? ? 將40%甘油與菌液以1：1體積比混合,即最終甘油濃度為20%醇王。凍存用的菌液濃度宜高呢燥，避免凍存過程中的損耗。
(六)細菌的定量
? ?1.經(jīng)驗參數(shù)法：酶標儀檢測菌液0D600nm,若D600mm≈0.4,則說明細菌數(shù)量約為5x10E8個
? ?2.逐級稀釋法：不同菌株的經(jīng)驗參數(shù)值略有差異寓娩，因此首次對某一菌株進行定量時叛氨，應采用4000rpm，離心20min棘伴，收集菌液力试，取0.1mL菌液添加到9.9mLPBS/生理鹽水中,得到1/100稀釋比率溶液，經(jīng)過3次稀釋排嫌，最后一管的樣品的最終稀釋率為：1/1000000畸裳。
然后向固體培養(yǎng)基上涂布0.1mL的1/10E-6稀釋液，生長的單菌落數(shù)為n個,則最初的樣本中的細菌數(shù)為nx10E8個淳地，計數(shù)方法如下:
? ? 細菌數(shù)/mL=(最終平板菌落數(shù)/稀釋率)÷涂布體積=(n/10E-6)÷01 mL=nx10E8 mL怖糊。
