第二十章：高效液相色譜法
與經(jīng)典色譜比較優(yōu)點(diǎn)：
- 柱效高
- 流速快版姑、分析速度快
- 靈敏度高
與氣相色譜比較：
- 不受揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性影響
- 可選用不同溶劑作為流動(dòng)相檐蚜，分離選擇性高
- 不需要高柱溫
第一節(jié)：高效液相色譜法主要類型
高效液相色譜法分類
按固定相聚集狀態(tài)：液液色譜法咖祭、液固色譜法
按分離機(jī)制：分配污筷、吸附妙啃、離子交換跋选、分子排阻四類基本機(jī)制
其他分離機(jī)制：親和色譜法、手性色譜法官脓、膠束色譜法、電色譜法涝焙、生物色譜法
目前最常用固定相是化學(xué)鍵和相卑笨，稱為化學(xué)鍵和色譜法
化學(xué)鍵和相色譜法
鍵合相：通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)基團(tuán)鍵合在載體表面構(gòu)成的固定相
正相NP、反相RP
正相鍵合色譜法
采用氰基仑撞、氨基等作為固定相赤兴，非極性或弱極性溶劑為流動(dòng)相妖滔。
分離極性至中等極性分子行化合物
分離機(jī)制一般認(rèn)為是分配，也有認(rèn)為是吸附如形成氫鍵的
一般規(guī)律：劑型強(qiáng)的組分容量因子k大桶良，后出座舍。流動(dòng)相極性增強(qiáng)洗脫能力增強(qiáng)
反相鍵合相色譜法
十八烷基硅烷、辛烷基硅烷等陨帆，有時(shí)也用弱極性或中等極性
流動(dòng)相以水作為基礎(chǔ)溶劑再加一定量極性調(diào)整劑
分離機(jī)制有爭(zhēng)論曲秉，多種理論模型
影響組分保留行為的主要因素：
組分分子結(jié)構(gòu)：極性強(qiáng)弱
-
流動(dòng)相：k的對(duì)數(shù)值與流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的含量通常是線性關(guān)系，有機(jī)溶劑含量增加疲牵，k減小承二。
流動(dòng)相pH通過(guò)改變組分理解程度改變tR，因此常加入少量弱酸纲爸、弱堿亥鸠、緩沖液從而抑制組分離解，增加與固定相作用识啦，這種色譜法稱為離子抑制色譜法（ISC）负蚊，適用于pKa3~7，pKa7~8的組分颓哮。組分離子態(tài)與分子態(tài)共存會(huì)使峰變寬拖尾家妆。還要注意流動(dòng)相pH不能超過(guò)允許范圍
固定相：鍵合烷基的長(zhǎng)度，濃度越大题翻，k越大
分離非極性至中等極性組分
反相離子對(duì)色譜
離子對(duì)色譜法（IPC）分正相和反相揩徊，正相已經(jīng)少用。
反相離子對(duì)色譜法（RP-IPC）是把離子對(duì)試劑加入到含水流動(dòng)相中嵌赠，使被分析組分離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子生成不帶電荷的中性離子塑荒，使組分k增加，用于分離可離子化或離子型化合物
離子對(duì)模型（保留機(jī)制）：試樣離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑離解出的反離子生成不帶電荷的中性離子姜挺，然后在非極性固定相上產(chǎn)生保留齿税。
-
影響容量因子的因素：
-
離子對(duì)試劑的種類和濃度：酸類一般用季銨鹽（TBA，CTAB）炊豪，堿類一般用烷基磺酸鹽或硫酸鹽（PICB）凌箕。
組分分配系數(shù)隨離子對(duì)試劑濃度升高而增大，然后趨于穩(wěn)定词渤。對(duì)于長(zhǎng)鏈離子對(duì)試劑牵舱，當(dāng)離子對(duì)試劑濃度超過(guò)一定值時(shí)，k反而減小缺虐，是因?yàn)樾纬闪四z束芜壁。
流動(dòng)相pH：調(diào)節(jié)pH使離子對(duì)試劑完全離子化時(shí)最有利于離子對(duì)形成
有機(jī)溶劑及其濃度：流動(dòng)相中所含有機(jī)溶劑比例越高組分k越小
-
用于生物堿類、兒茶酚胺類、有機(jī)酸類慧妄、維生素類顷牌、抗生素類藥物分析
其他高效液相色譜法
離子色譜法
離子色譜法：將離子交換色譜與電導(dǎo)檢測(cè)器相結(jié)合分析各種離子的方法
可以分析無(wú)機(jī)和有機(jī)陰陽(yáng)離子，氨基酸塞淹、糖類窟蓝、DNA和RNA的降解產(chǎn)物
分為抑制型（雙柱型）、非抑制型（單柱型）
對(duì)于X-離子：
雙柱型使用兩根離子交換柱饱普，一根為分離柱运挫，填有低交換容量的陰離子交換劑，另一根為抑制住费彼，填有高交換容量的陽(yáng)離子交換劑滑臊，兩者串聯(lián)。進(jìn)入分離柱的組分X-按正常離子交換色譜分離箍铲，在進(jìn)入抑制柱雇卷，除去組分中的OH-從而使本底電導(dǎo)率降低，利于較大電導(dǎo)率HX的檢測(cè)颠猴。
非抑制型可使用更低交換容量的固定相关划，濃度很低、電導(dǎo)率很低的流動(dòng)相翘瓮，這樣本底電導(dǎo)率低贮折，試樣離子被洗脫后可直接被電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)
手性色譜法
利用手性固定相（CSP）、手性流動(dòng)相添加劑（CMPA）分離分析手性化合物的對(duì)映異構(gòu)體的色譜方法资盅。還有間接法（加入手性試劑使一對(duì)對(duì)映體轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映體用常規(guī)方法分離）调榄。
環(huán)糊精（CD）也是一種手性選擇劑，分離機(jī)制主要是由于分子內(nèi)熟睡空腔的動(dòng)銷和多手性中心的作用呵扛，如果對(duì)映體能被空腔緊密包絡(luò)每庆，而且與CD分子外沿的仲醇基作用，則被固定相保留今穿，兩對(duì)映體與CD作用程度不同從而分離缤灵。
親和色譜法
親和色譜法（AC）利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從復(fù)雜試樣中分離和分析能產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性親和作用的物質(zhì)的一種色譜方法蓝晒。選擇性最高腮出。
第二節(jié)：高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相
高效液相色譜法的固定相
要求：顆粒細(xì)且均勻、傳質(zhì)快芝薇、機(jī)械強(qiáng)度高胚嘲、耐高壓，化學(xué)穩(wěn)定性好
液固：全多空硅膠洛二、高庚子多空微球
應(yīng)用最多的是化學(xué)鍵和相
常用化學(xué)鍵和相的種類和性質(zhì)
- 常用化學(xué)鍵和相的種類
- 非極性鍵合相：十八烷基硅烷（ODS）最常用馋劈。一般用于反相色譜立倍。長(zhǎng)鏈k大，載樣量高侣滩，穩(wěn)定性好。短鏈分離速度快变擒，色譜峰對(duì)稱性好君珠，苯基鍵合與短鏈相似。
- 弱極性鍵合相：醚基和二羥基鍵合相娇斑，應(yīng)用少
- 極性鍵合相：氨基策添、氰基，一般用于正相色譜毫缆。氰基分離選擇性類似于硅膠唯竹，對(duì)雙鍵有選擇性，對(duì)雙鍵異構(gòu)體苦丁，或含雙鍵數(shù)不同的環(huán)狀化合物有較好分離能力浸颓。一些硅膠上不能分離的極性強(qiáng)的化合物也可在氰基上分離。氨基鍵合相與酸性硅膠有不同性能旺拉，氨基可與糖分子羥基選擇性作用产上，從而分離糖。在酸性介質(zhì)中還是弱陰離子交換劑蛾狗，能分離核苷酸晋涣。但是與羰基反應(yīng)
- 鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)
- 鍵合反應(yīng)：主要是硅氧烷型鍵合相，以氯硅烷與硅膠進(jìn)行硅烷化反應(yīng)而制的
- 含碳量和覆蓋度：鍵合相表面基團(tuán)的鍵合量可以對(duì)鍵合硅膠進(jìn)行元素分析沉桌，用含碳的百分?jǐn)?shù)表示谢鹊。覆蓋度參加反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。在鍵合反應(yīng)后用三甲基氯硅烷進(jìn)行鈍化處理留凭，即封尾佃扼，減少對(duì)極性組分的吸附。
- 鍵合相特點(diǎn)：化學(xué)穩(wěn)定性好冰抢，壽命長(zhǎng)松嘶；均一性和重現(xiàn)性好；柱效高挎扰，選擇性好翠订；適于梯度洗脫；載樣量大
其他種類固定相
- 鍵合型離子交換劑：常用陽(yáng)離子型鍵合相是強(qiáng)蘇醒磺酸類遵倦；常用陰離子型鍵合相是季銨鹽類尽超；還有弱酸（堿）型離子交換劑
- 手性固定相（CSP）：蛋白類、多糖類梧躺、環(huán)糊精似谁、π-氫鍵型（刷型）傲绣、大環(huán)抗生素類、配體交換巩踏、其他秃诵。載樣量小，穩(wěn)定性差且價(jià)格昂貴塞琼。
- 親和色譜固定相：配基和載體間有一適當(dāng)長(zhǎng)度間隔臂
高效液相色譜法的流動(dòng)相
要求：化學(xué)穩(wěn)定性好菠净；適宜溶解度；與檢測(cè)器相適應(yīng)彪杉；純度高毅往；粘度低
使用前經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，除去固體顆粒派近，還要脫氣處理
流動(dòng)相對(duì)分離的影響
分離方程式：
選擇合適的溶劑強(qiáng)度使組分k在最佳范圍內(nèi)攀唯，選擇合適種類的溶劑改善選擇性使α增大獲得良好分離度R>1.5
溶劑極性和強(qiáng)度
在化學(xué)鍵和色譜中溶劑洗脫能力即溶劑強(qiáng)度直接與它的極性相關(guān)。
溶劑極性用溶劑極性參數(shù)表示渴丸，用以表示正相色譜中洗脫能力
反相鍵合相色譜溶劑強(qiáng)度用另一強(qiáng)度因子S表示
混合溶劑可以用P或S的加權(quán)平均表示
第三節(jié)：高效液相色譜速率理論和分離方法選擇
高效液相色譜速率理論
柱內(nèi)展寬
- 渦流擴(kuò)散：
侯嘀，λ為不規(guī)則系數(shù)，dp為平均直徑
- 縱向擴(kuò)散：
谱轨，Dm與流動(dòng)相粘度成反比残拐，與溫度呈正比，一般可以忽略
- 傳質(zhì)阻抗：
- 固定相傳質(zhì)阻抗：鍵合相厚度可以囫圇碟嘴，固定相傳質(zhì)阻抗可以忽略
- 流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗：
溪食，dp固定相顆粒直徑，Dm組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)娜扇，ω有色譜柱及其填充情況決定
- 靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗：由于組分的部分分子是先進(jìn)入滯留在固定相微孔內(nèi)的靜態(tài)流動(dòng)相中错沃，再與固定相進(jìn)行分配，因而較晚回到流路引起色譜峰展寬雀瓢。與dp平方成正比枢析，與Dm成反比，如果固定相微孔多且又深又小刃麸，峰展寬就越嚴(yán)重
- 注意兩種粘度不同物質(zhì)混合醒叁，其粘度不呈線性，一般選用低粘度洗脫劑
HPLC速率理論方程：
- 固定相顆粒度對(duì)塔板高度影響：固定相顆粒粒度越小三個(gè)參數(shù)越小泊业，所以減小dp是保證HPLC高柱效的主要措施
柱外展寬
盡可能減小柱外死體積
高效液相色譜分離方法選擇
（349頁(yè)圖）
第四節(jié)：高效液相色譜儀
高效液相色譜儀一般由高壓輸液系統(tǒng)把沼、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱分離系統(tǒng)吁伺、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成
高壓輸液系統(tǒng)
- 高壓輸液泵：流量精度高饮睬，穩(wěn)定；流量范圍寬篮奄；能在高壓下連續(xù)工作捆愁，液缸容積懈钊ァ；密封性能好昼丑，耐腐蝕
- 分為恒壓泵和恒流泵
- 注意事項(xiàng)：防止固體微粒進(jìn)入呻逆；流動(dòng)相不含腐蝕性物質(zhì)；防止溶劑瓶?jī)?nèi)流動(dòng)相用完菩帝；不要超過(guò)規(guī)定最高壓力页慷；流動(dòng)相先脫氣
- 梯度洗脫裝置：分為低壓梯度和高壓梯度，低壓梯度需要在線脫氣裝置
進(jìn)樣系統(tǒng)
- 六通閥手動(dòng)進(jìn)樣裝置：重現(xiàn)性好胁附，能耐高壓
- 自動(dòng)進(jìn)樣裝置：
色譜柱分離系統(tǒng)
- 色譜柱：分為分析型和制備型。制備型柱內(nèi)徑大滓彰。內(nèi)徑根據(jù)柱長(zhǎng)控妻、填料粒徑、折合流速確定揭绑，目的是避免管壁效應(yīng)
- 保護(hù)柱：裝有與分析柱相同固定相填料的短柱弓候，在色譜柱前，用來(lái)保護(hù)色譜柱
- 柱溫箱：
- 色譜柱評(píng)價(jià)：色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
檢測(cè)系統(tǒng)
檢測(cè)器的功能
分類：
- 專屬型：紫外他匪、熒光
- 通用型：示差折光菇存、蒸發(fā)光
要求：靈敏度高、噪聲低邦蜜、線性范圍寬依鸥、重復(fù)性好、適用范圍廣
紫外檢測(cè)器
紫外檢測(cè)器UVD：不破壞樣品悼沈，只能檢測(cè)有紫外吸收物質(zhì)贱迟、對(duì)流動(dòng)相有限制
- 可變波長(zhǎng)檢測(cè)器：氘燈/鎢燈，但是單色光強(qiáng)度低
- 光電二極管陣列檢測(cè)器（PDAD或DAD）：同時(shí)檢測(cè)多種波長(zhǎng)
熒光檢測(cè)器
熒光檢測(cè)器FD：靈敏度更高絮供，只適用于產(chǎn)生熒光物質(zhì)衣吠，體內(nèi)藥物分析常用
安培檢測(cè)器
電化學(xué)檢測(cè)器ECD：極譜、庫(kù)侖壤靶、安培缚俏、電導(dǎo)。電導(dǎo)用于離子檢測(cè)贮乳，安培應(yīng)用廣泛忧换，靈敏度高適用于痕量組分分析，凡是具有氧化還原活性的都能進(jìn)行檢測(cè)
蒸發(fā)光散射檢測(cè)器
蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD：適用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的組分向拆，用于糖類包雀、高級(jí)脂肪酸、磷脂亲铡、維生素才写、氨基酸葡兑、三酰甘油及甾體；對(duì)各種物質(zhì)幾乎有相同響應(yīng)赞草；但是靈敏度低讹堤，流動(dòng)相必須是揮發(fā)性不能含有緩沖鹽。
數(shù)據(jù)記錄處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)
儀器自動(dòng)化：
采集和分析色譜數(shù)據(jù)：
中心計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)：
第五節(jié)：超高效液相色譜法簡(jiǎn)介
超高效液相色譜法UPLC：借助于HPLC理論及原理厨疙，利用小顆粒固定相洲守，非常低的系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等技術(shù)，使分離度沾凄、分析速度梗醇、檢測(cè)靈敏度及色譜峰容量大大提高，從而全面提升了液相色譜的分離分析效能撒蟀。
操作條件比較（355表）
優(yōu)點(diǎn)：分析速度快叙谨；分離效能高；靈敏度高——小顆粒技術(shù)和整體化儀器設(shè)計(jì)
理論基礎(chǔ)
van Deemter方程保屯，可以發(fā)現(xiàn)固定相粒度越小手负，分離度越大。同時(shí)粒度越小姑尺，最佳流動(dòng)相線速度越大竟终，并有更寬優(yōu)化范圍，因此降低粒度可以提高分析速度切蟋。但是會(huì)增加系統(tǒng)柱壓差统捶，受到固定相機(jī)械強(qiáng)度和色譜儀系統(tǒng)耐壓性限制
實(shí)現(xiàn)超高效液相色譜必要條件
- 解決小顆粒固定相耐壓?jiǎn)栴}
- 解決小顆粒固定相裝填問(wèn)題，包括粒度分布及色譜柱結(jié)構(gòu)
- 超高壓輸液泵的使用
- 使用低擴(kuò)散柄粹、低交叉污染的快速自動(dòng)進(jìn)樣器瘾境，配備針內(nèi)進(jìn)樣探頭和壓力輔助進(jìn)樣技術(shù)
- 高速檢測(cè)器：優(yōu)化流通池解決高速檢測(cè)和擴(kuò)散問(wèn)題
- 實(shí)現(xiàn)完善的系統(tǒng)整體性設(shè)計(jì)降低整個(gè)系統(tǒng)體積，特別是死體積镰惦，解決超高壓下耐壓及滲漏問(wèn)題
- 系統(tǒng)控制及數(shù)據(jù)管理迷守，解決高速數(shù)據(jù)采集、儀器控制旺入，此外還可實(shí)現(xiàn)超高效液相分析方法與高效液相分析方法的自動(dòng)化
應(yīng)用前景
- 高通量篩選
- 天然產(chǎn)物分析
- 蛋白質(zhì)組學(xué)兑凿、基因組學(xué)、代謝組學(xué)
- 食品分析
- 環(huán)境分析
第六節(jié)：定性與定量分析方法
定性分析方法
- 色譜鑒定法：
- 利用保留時(shí)間定性：調(diào)整流動(dòng)相多次比較茵瘾，沒(méi)有保留指數(shù)可利用
- 利用加入標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品增加峰高定性：
- 化學(xué)鑒定法：用專屬化學(xué)反應(yīng)對(duì)色譜分離后收集的組分進(jìn)行定性分析
- 色譜-光譜聯(lián)用鑒定法：
定量分析方法
常用外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)礼华，少用歸一化。對(duì)藥品中雜質(zhì)含量測(cè)定常用主成分自身對(duì)照法
主成分對(duì)照法分為不加校正因子和加校正因子兩種：
- 無(wú)雜質(zhì)對(duì)照拗秘，不加校正因子圣絮，把供試樣品稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照溶液，調(diào)整儀器靈敏度使對(duì)照溶液主成分峰高適當(dāng)雕旨，然后取原溶液與稀釋后溶液進(jìn)樣扮匠，以供試品溶液上各雜質(zhì)峰面積有對(duì)照溶液主成分面積比較捧请，計(jì)算雜質(zhì)含量
- 加校正因子，需要有各雜質(zhì)和主成分對(duì)照品棒搜，先測(cè)定雜質(zhì)校正因子再以對(duì)照溶液調(diào)整儀器靈敏度疹蛉，然后測(cè)定供試品溶液色譜上個(gè)雜質(zhì)峰面積，分別乘以相對(duì)校正因子后于對(duì)照溶液主成分峰面積比較力麸，計(jì)算雜質(zhì)含量
注意進(jìn)行色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：理論塔板數(shù)可款、分離度、拖尾因子和重復(fù)性
