文獻(xiàn)

2023

Genome Biology

Single-cell resolution analysis reveals the preparation for reprogramming the fate of stem cell niche in cotton lateral meristem

課題背景

植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是一種將各種組織的體細(xì)胞體外培養(yǎng)楣颠，經(jīng)歷脫分化和再分化形成體細(xì)胞胚胎的過(guò)程茵宪。關(guān)于體細(xì)胞胚胎起源于外植體組織中的單個(gè)細(xì)胞還是多個(gè)細(xì)胞叉趣，以及控制細(xì)胞重新編程以啟動(dòng)胚胎發(fā)育的機(jī)制，目前的研究仍然有限。?

棉花是研究體細(xì)胞胚胎發(fā)生的重要模型示损，它可以產(chǎn)生胚胎發(fā)生愈傷組織（EC）和非胚胎發(fā)生愈傷組織（NEC）。影響棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的主要因素是外植體基因型。目前祥楣，只有極少數(shù)基因型，如Coker 201/310/312/315汉柒，ZM24误褪，Simian 3，YZ1和 Jin668碾褂，通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生展現(xiàn)出較高的再生效率兽间。在這些基因型中，Jin668在遺傳工程和基因編輯中被廣泛應(yīng)用正塌。然而嘀略，其強(qiáng)大的再生能力機(jī)制尚不清楚恤溶。?

近年來(lái)，體細(xì)胞胚胎發(fā)生的形態(tài)和分子機(jī)制已成為研究的新焦點(diǎn)帜羊，轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為在其中起著重要的調(diào)控作用咒程。某些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子已被用于提高植物再生效率，其中包括BBM讼育、EMK帐姻、SERF1、WIND1奶段、WIND2饥瓷、WIND3、WIND4 痹籍、WUS2呢铆、AGL15、LEC1词裤、LEC2 刺洒、FUS3、GRF-GIF吼砂、STM逆航、KN1、ESR1渔肩、ESR2以及MP等因俐。除了轉(zhuǎn)錄因子，其他蛋白編碼基因和表觀遺傳調(diào)控也調(diào)節(jié)體細(xì)胞的重編程過(guò)程周偎。在棉花中抹剩，GhHmgB3 、GhCK蓉坎、GhL1L1 和 GhTCE1 調(diào)節(jié)脫分化過(guò)程澳眷。在棉花中，體細(xì)胞胚胎發(fā)生期間的基因調(diào)控細(xì)節(jié)以及基因型依賴(lài)的再生過(guò)程仍然未知蛉艾。

先前的研究表明在使用棉花下胚軸段作為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化時(shí)钳踊，農(nóng)桿菌主要侵染初生維管組織。盡管植物細(xì)胞具有很高的再生潛力勿侯，但這一過(guò)程的時(shí)空限制也與干細(xì)胞拓瞪、分生組織細(xì)胞或高度可重編程細(xì)胞的位置密切相關(guān)。因此助琐，準(zhǔn)確的分析體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上的重編程過(guò)程祭埂，對(duì)于改善我們對(duì)植物再生調(diào)控機(jī)制的理解具有巨大的潛在價(jià)值。?

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的迅速發(fā)展為在單細(xì)胞水平鑒定基因表達(dá)模式和解析體細(xì)胞胚胎發(fā)生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了前所未有的機(jī)會(huì)兵钮。擬南芥根的單細(xì)胞景觀顯示出高度異質(zhì)性蛆橡，不同細(xì)胞簇中存在不同的離子吸收和激素反應(yīng)模式舌界。從水稻和擬南芥根的scRNA-seq數(shù)據(jù)比較分析表明，大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄組差異很大航罗，強(qiáng)調(diào)了對(duì)物種特異性組織進(jìn)行單細(xì)胞分析的重要性禀横。

亮點(diǎn)

為了探索組織培養(yǎng)中棉花下胚軸初生維管組織的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)，作者在愈傷組織誘導(dǎo)后的0粥血、1柏锄、6和12小時(shí)，使用棉花栽培品種TM-1（難再生）和Jin668（再生能力強(qiáng)）進(jìn)行了scRNA-seq分析复亏。并且利用基因編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)趾娃，對(duì)scRNA-seq鑒定出的LAX2、LAX1和LOX3基因的作用機(jī)制進(jìn)行了解析缔御√疲總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究以單細(xì)胞分辨率提供了棉花下胚軸不同細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄組景觀耕突，并確定了調(diào)控植物再生的候選基因笤成。

結(jié)論1?棉花下胚軸去分化過(guò)程中單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜

Fig 1a-b

下胚軸是農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花遺傳轉(zhuǎn)化的主要外植體（Fig 1a-b），之前的研究已經(jīng)表明眷茁，農(nóng)桿菌主要在棉花下胚軸的初生維管組織中表達(dá)轉(zhuǎn)化的基因炕泳，然后通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織和再生植株。

Fig 1c-d

下胚軸維管束的形成層呈環(huán)狀排列上祈，這是雙子葉植物的典型特征（Fig 1c）培遵。在19℃下與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)48小時(shí)后，Jin668和TM-1的下胚軸原生維管組織中均能檢測(cè)到在CaMV-35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下表達(dá)的GFP和RFP（Fig 1d）登刺。轉(zhuǎn)基因表達(dá)主要在兩個(gè)基因型的相同組織中觀察到籽腕，這表明棉花下胚軸的初生維管組織最有能力表達(dá)轉(zhuǎn)基因，可能是因?yàn)樗拇x和轉(zhuǎn)錄活性更高纸俭，或者細(xì)胞質(zhì)密度更大皇耗。

Fig 2a

作者使用scRNA-seq技術(shù)，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)前后的Jin668和TM_1進(jìn)行了分析揍很。在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)（培養(yǎng)0廊宪、1、6和12小時(shí)）獲得了單細(xì)胞的原生質(zhì)體女轿，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有兩個(gè)獨(dú)立的重復(fù)（Fig 2a），使用10 × Genomics的scRNA-seq平臺(tái)對(duì)每個(gè)樣品約100,000個(gè)原生質(zhì)體進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序壕翩。

Fig S1b

經(jīng)過(guò)細(xì)胞和基因水平的質(zhì)控蛉迹，獲得了Jin668的30,357個(gè)細(xì)胞和TM-1的29,234個(gè)細(xì)胞，兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間一致性較好（Fig S1b）放妈。

Fig 2b-c

為了進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞聚類(lèi)和注釋?zhuān)總€(gè)樣本的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)被合并北救，利用UMAP進(jìn)行降維（Fig 2b-c）荐操。

Fig 2d-e

從PsctH獲取植物中典型的marker基因以進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型的注釋。對(duì)于Jin668（命名為Jin0到Jin8）和TM-1（命名為T(mén)M0到TM8）的每個(gè)細(xì)胞簇珍策，選取了前50個(gè)marker基因托启，用于匹配細(xì)胞類(lèi)型。marker基因的擬同源基因被鑒定并用于注釋這些細(xì)胞簇（Fig 2d）攘宙。通過(guò)這一策略屯耸，大致確定了Jin668和TM-1下胚軸的主要細(xì)胞類(lèi)型，包括表皮蹭劈、皮層疗绣、木質(zhì)部導(dǎo)管、初生木質(zhì)部铺韧、初生韌皮部多矮、形成層和薄壁組織。

為了確認(rèn)細(xì)胞簇分類(lèi)的準(zhǔn)確性哈打，作者選擇了在Jin668和TM-1中都表達(dá)的基因作為RNA原位雜交的marker基因塔逃。其中，Ghir_A01G019320和Ghir_A10G018730是新鑒定的marker基因料仗，分別在棉花下胚軸的初生木質(zhì)部和初生韌皮部中表達(dá)（Fig 2e）湾盗。此外，一些在Jin668細(xì)胞簇中富集的基因也在TM-1的相同位置表達(dá)罢维。這些數(shù)據(jù)表明所鑒定的細(xì)胞類(lèi)型是正確的淹仑，并且Jin668和TM-1具有類(lèi)似的細(xì)胞類(lèi)型。

結(jié)論3?棉花下胚軸的初生維管細(xì)胞是體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中啟動(dòng)細(xì)胞重編程的主要細(xì)胞類(lèi)型

Fig 3a-b

不同細(xì)胞類(lèi)型在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中如何對(duì)外部刺激作出反應(yīng)肺孵？

為了解答這個(gè)問(wèn)題匀借，作者將TM-1和Jin668的所有單細(xì)胞數(shù)據(jù)合并（稱(chēng)為Cotton），使用t-SNE和UMAP進(jìn)行聚類(lèi)平窘，并對(duì)這些細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行了注釋?zhuān)‵ig 3a）吓肋。為了進(jìn)一步表征這些細(xì)胞cluster，作者鑒定了同種細(xì)胞類(lèi)型的差異表達(dá)基因瑰艘。

通過(guò)韋恩圖發(fā)現(xiàn)在所有主要細(xì)胞類(lèi)型中（包括表皮是鬼、皮層和原生維管組織），TM-1和Jin668之間有超過(guò)80%的類(lèi)似表達(dá)基因（Fig 3b）紫新。韌皮部篩管是個(gè)例外均蜜。

Fig 3c-d

為了識(shí)別參與體細(xì)胞胚胎發(fā)生的細(xì)胞類(lèi)型，作者在合并的細(xì)胞簇中檢查了與生長(zhǎng)素合成芒率、生長(zhǎng)素響應(yīng)囤耳、傷口誘導(dǎo)、細(xì)胞分裂素和表觀遺傳調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)模式（Fig 3c）。對(duì)于這些基因充择，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诔跎S管組織（Cotton2德玫、Cotton3和Cotton8）中高表達(dá)。例如椎麦，生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍譒AX2是一種用于調(diào)控維管紋理的基因宰僧，主要在被鑒定的Cotton3（薄壁細(xì)胞）中表達(dá)。傷口響應(yīng)家族蛋白WIP1观挎、IAA轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族蛋白IAA4和乙烯應(yīng)答元素結(jié)合蛋白EBP在Cotton2（原生木質(zhì)部）高表達(dá)琴儿，但在成熟木質(zhì)部（Cotton6）不表達(dá)。

然而键兜，另一個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)家族蛋白基因EFE在Cotton5簇（皮層）中富集凤类，而生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆駻UX1在Cotton8（形成層）中活躍。通過(guò)組織學(xué)切片證明下胚軸形成層在培養(yǎng)基誘導(dǎo)3天后開(kāi)始增殖（Fig 3d）普气。這些結(jié)果表明谜疤，初生維管組織，尤其是形成層和維管薄壁組織现诀，在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中是對(duì)激素誘導(dǎo)作出響應(yīng)的主要區(qū)域夷磕。

結(jié)論4?Jin668下胚軸的初生維管細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)素響應(yīng)基因表達(dá)模式

Fig 4a

TM-1和Jin668之間細(xì)胞cluster的相似性促使我們探究單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的保守性和異質(zhì)性。為此仔沿，作者在相同的細(xì)胞類(lèi)型坐桩、相同的誘導(dǎo)時(shí)間下，比較了Jin668和TM-1的基因表達(dá)譜封锉，以進(jìn)一步了解細(xì)胞命運(yùn)向胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)變绵跷。

在表皮、皮層成福、和韌皮部中碾局，差異表達(dá)基因 (DEGs) 大多與各自細(xì)胞類(lèi)型的功能相關(guān)。在原生木質(zhì)部中奴艾，約1%的DEGs净当、薄壁細(xì)胞中約1%的DEGs以及形成層中約2%的DEGs與植物再生有關(guān)。其中蕴潦，許多基因與激素響應(yīng)有關(guān)像啼，包括ACT3、EMB2448潭苞、ERS和EBP（Fig 4a）忽冻。這些細(xì)胞類(lèi)型是在愈傷組織誘導(dǎo)早期階段經(jīng)歷命運(yùn)轉(zhuǎn)變的主要細(xì)胞類(lèi)型。

Fig 4b

為了更好地理解Jin668和TM-1的木質(zhì)部和薄壁細(xì)胞內(nèi)基因的時(shí)空表達(dá)模式此疹，作者比較了四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)趨勢(shì)甚颂。由于Jin668可以實(shí)現(xiàn)再生而TM-1不能蜜猾，所以重點(diǎn)關(guān)注了在相應(yīng)基因型的細(xì)胞簇中表達(dá)趨勢(shì)相反的基因。

傷口誘導(dǎo)基因WIND1和ANAC071在Jin668和TM-1中均表達(dá)振诬。其中，WIND1主要在薄壁細(xì)胞和形成層細(xì)胞中表達(dá)衍菱，在Jin668中上調(diào)赶么，在TM-1中下調(diào)。而ANAC071在Jin668和TM-1的原生細(xì)胞中有不同的表達(dá)趨勢(shì)脊串。生長(zhǎng)素響應(yīng)相關(guān)基因AHL15辫呻、LBD16、LBD18和LBD19琼锋，生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF19和E2Fa放闺，以及生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因TET3在原生木質(zhì)部和薄壁細(xì)胞簇中表達(dá)。TET3主要在薄壁細(xì)胞中表達(dá)缕坎，在Jin668和TM-1中的趨勢(shì)完全相反怖侦。

AUX1/LAX依賴(lài)的生長(zhǎng)素內(nèi)流在早期胚胎發(fā)生后就對(duì)細(xì)胞形態(tài)的形成起重要作用。作者發(fā)現(xiàn)LAX2只在形成層細(xì)胞中表達(dá)谜叹，并在Jin668和TM-1中呈現(xiàn)出明顯不同的表達(dá)模式（Fig 4b）匾寝。

Fig 4c-d

為了識(shí)別在Jin668中特異表達(dá)的基因，作者比較了Jin668和TM-1的數(shù)據(jù)荷腊，獲取了特異在Jin668原生木質(zhì)部艳悔、形成層和薄壁細(xì)胞中表達(dá)的基因（Fig 4c-d），然后對(duì)這些基因進(jìn)行功能注釋女仰。

在初生木質(zhì)部中猜年，鑒定出81個(gè)在Jin668中特異表達(dá)的基因，包括細(xì)胞分裂素代謝相關(guān)基因CKX3疾忍、脫落酸生物合成基因ICE1乔外、生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因PLC2和生長(zhǎng)素極性轉(zhuǎn)運(yùn)基因PIS1。在Jin668的形成層區(qū)域锭碳，檢測(cè)到生長(zhǎng)素相關(guān)基因MYB44袁稽、MYB73、CSEF擒抛、PIS1推汽，乙烯響應(yīng)相關(guān)基因RAP2.11、PDR12歧沪、FER歹撒，傷口響應(yīng)基因Ghir_D12G014280、Ghir_A06G021760诊胞。

有趣的是暖夭，與生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因在Jin668的這三種細(xì)胞類(lèi)型中均下調(diào)（Fig 4c-d）锹杈。鑒于Jin668中的生長(zhǎng)素內(nèi)流基因AUX/LAX富集且上調(diào)，生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸和分布可能在經(jīng)歷重分化的細(xì)胞中非常重要迈着，而這些Jin668細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下更有可能產(chǎn)生愈傷組織并形成體細(xì)胞胚胎竭望。

結(jié)論5?愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中下胚軸維管細(xì)胞連續(xù)分化軌跡的重建

Fig 5a-b

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組能夠幫助我們探索愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞的發(fā)育軌跡。前面提到裕菠，與細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變相關(guān)的基因在初生維管組織中富集（Fig 3c）咬清。為了構(gòu)建愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中下胚軸維管細(xì)胞的重建軌跡，作者使用Monocle2對(duì)代表這些細(xì)胞類(lèi)型的簇進(jìn)行了偽時(shí)序分析奴潘。通過(guò)使用薄壁細(xì)胞旧烧、形成層和原生木質(zhì)部的數(shù)據(jù)，展示了不同分支的發(fā)育狀態(tài)画髓。在Jin668中掘剪，分化始于形成層和薄壁細(xì)胞，原生木質(zhì)部和木質(zhì)導(dǎo)管前體分別分為不同的分支奈虾。這些狀態(tài)分別命名為JPC（Jin668薄壁細(xì)胞/形成層）夺谁、JPX（Jin668原生木質(zhì)部）和JXV（Jin668木質(zhì)導(dǎo)管前體，F(xiàn)ig 5a）愚墓。TM-1的軌跡分化與Jin668類(lèi)似予权，起始分支是TPC（TM-1薄壁細(xì)胞），最終分支是TPX（TM-1原生木質(zhì)部）和TXV（TM-1木質(zhì)導(dǎo)管前體浪册，F(xiàn)ig 5b）扫腺。

Fig 5c-e

生長(zhǎng)素的空間分布對(duì)于形成層的維持至關(guān)重要。GO富集分析發(fā)現(xiàn)村象，偽時(shí)序分析的起點(diǎn)主要富集到與“生長(zhǎng)素外流”笆环、“生長(zhǎng)素極性轉(zhuǎn)運(yùn)”和“生長(zhǎng)素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)器活性”相關(guān)的GO term（Fig 5e）。生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因WAT1和IAA4在Jin668和TM-1細(xì)胞簇的分支起點(diǎn)富集厚者，支持生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)參與調(diào)節(jié)形成層細(xì)胞活性的觀點(diǎn)（Fig 5c-d）躁劣。

作者在Jin8和TM3中鑒定出顯著更多的DEGs。值得注意的是库菲，生長(zhǎng)素內(nèi)流載體基因LAX1账忘，和LAX2僅在Jin668的起始分支中表達(dá)，這表明在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中熙宇，Jin668和TM-1的形成層細(xì)胞在生長(zhǎng)素分布模式上可能存在差異鳖擒。

在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中，生長(zhǎng)素在體胚極性的建立中扮演重要角色烫止，生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因影響體細(xì)胞獲得胚性能力蒋荚。生長(zhǎng)素極性轉(zhuǎn)運(yùn)基因PIN1主要分布在軌跡的初始分支和初生木質(zhì)部。這意味著這些細(xì)胞之間的生長(zhǎng)素流動(dòng)可能會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化馆蠕，生長(zhǎng)素的分布可能會(huì)影響細(xì)胞命運(yùn)期升。為了探索不同組織的分化軌跡惊奇，作者進(jìn)一步研究了XV（木質(zhì)導(dǎo)管前體）和PX（原生木質(zhì)部）分支之間的基因表達(dá)模式差異。結(jié)果顯示播赁，在XV分支中颂郎，無(wú)論是TM-1還是Jin668，在“木質(zhì)素代謝”行拢、“次生細(xì)胞壁生成的調(diào)控”和“植物細(xì)胞壁”的富集都表明這些細(xì)胞類(lèi)型正在經(jīng)歷細(xì)胞壁增厚和木質(zhì)化過(guò)程（Fig 5e）祖秒。有趣的是，JPX和TPX中優(yōu)先表達(dá)的基因富集在“側(cè)根發(fā)育”舟奠、“側(cè)根形態(tài)發(fā)生”、“對(duì)生長(zhǎng)激素的響應(yīng)”房维、“生長(zhǎng)素激活信號(hào)通路”和“細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)素刺激的響應(yīng)”等GO term中 沼瘫。在最終的細(xì)胞狀態(tài)中，存在受傷誘導(dǎo)的細(xì)胞響應(yīng)咙俩，包括ROS耿戚、乙烯和茉莉酸（JA）相關(guān)基因的積累。因此阿趁，作者推測(cè)在體胚發(fā)生過(guò)程中膜蛔，較少分化的細(xì)胞（如形成層細(xì)胞），更有可能經(jīng)歷脫分化形成愈傷組織并獲得胚性能力脖阵。此外皂股，作者還分析了可能影響兩個(gè)基因型中脫分化的DEGs。與TM-1相比命黔，生長(zhǎng)素相關(guān)基因PIN3呜呐、AFB2、ATHB2以及CSEF在Jin668的JPX中顯著高表達(dá)悍募，暗示這些基因可能參與了木質(zhì)部細(xì)胞的脫分化（Fig 5e）蘑辑。

總的來(lái)說(shuō)，作者認(rèn)為愈傷組織主要起源于初生木質(zhì)部細(xì)胞坠宴，形成層細(xì)胞可能在維持生長(zhǎng)素平衡方面起重要作用洋魂。初生木質(zhì)部和形成層細(xì)胞之間可能存在密集的細(xì)胞間通信，這影響了愈傷組織的形成和植物再生過(guò)程喜鼓。

結(jié)論6?RNA速率分析描述了棉花下胚軸向初生木質(zhì)部細(xì)胞的轉(zhuǎn)變

Fig 6a-b

RNA速率分析可用于量化組織培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞轉(zhuǎn)變副砍，并揭示Jin668和TM-1中的調(diào)控基因。

在Jin668中颠通，RNA速率分析鑒定到一個(gè)明顯的向初生木質(zhì)部細(xì)胞的流動(dòng)址晕，而在TM-1中，流動(dòng)朝向初生木質(zhì)部和表皮細(xì)胞（Fig 6a）顿锰。如預(yù)期所示煮落，前形成層細(xì)胞趨向于初生木質(zhì)部細(xì)胞胸梆，并橫跨薄壁細(xì)胞（Fig 6b）潮售。AUX-IAA基因ARF5和GH3.17（Fig 6b）顯示出從形成層細(xì)胞到初生木質(zhì)部的正向流動(dòng)，暗示它可能在激素誘導(dǎo)下引導(dǎo)木質(zhì)部細(xì)胞形成愈傷組織的過(guò)程發(fā)揮重要作用胳赌。有趣的是，成熟的細(xì)胞類(lèi)型匙隔，如木質(zhì)部和韌皮部疑苫，也表現(xiàn)出向前形成層發(fā)展的趨勢(shì)（Fig 6b），與脫分化過(guò)程一致纷责。

Fig 6c-d

此外捍掺，作者發(fā)現(xiàn)在這一過(guò)程中，SAUR51表現(xiàn)出最明顯的變化再膳，表明其在木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞脫分化中發(fā)揮了作用（Fig 6c）挺勿。相反，在TM-1中喂柒，薄壁細(xì)胞/形成層區(qū)域的流動(dòng)趨向于初生木質(zhì)部不瓶。與胚胎發(fā)育相關(guān)的基因EMB2739和與根發(fā)育相關(guān)的基因Ghir_A10G019630在最終狀態(tài)下表達(dá)，這意味著TM-1的初生木質(zhì)部最終可能分化為根細(xì)胞灾杰，而不是愈傷組織或體細(xì)胞胚胎（Fig 6d）蚊丐。

總的來(lái)說(shuō)，RNA速率分析和偽時(shí)序分析為棉花下胚軸組織培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞類(lèi)型發(fā)展和基因表達(dá)的重構(gòu)提供了新的見(jiàn)解艳吠。

結(jié)論7?基于scWGCNA揭示維管細(xì)胞分化和植物再生

Fig 7a-b

細(xì)胞的功能單位更有可能是通路而不是單個(gè)基因麦备。為了系統(tǒng)地研究Jin668和TM-1中的基因動(dòng)態(tài)調(diào)控，作者進(jìn)行了WGCNA讲竿。WGCNA檢測(cè)到Jin668的69個(gè)基因模塊和TM-1的60個(gè)基因模塊（Fig7a-b）泥兰，每個(gè)模塊包含一組在特定細(xì)胞類(lèi)型中傾向于共同表達(dá)的基因。

作者發(fā)現(xiàn)题禀，與分生組織維持以及胚胎極性建立相關(guān)的STM在Jin668的薄壁組織模塊的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中特異性表達(dá)鞋诗，這些基因?qū)τ谂咛O性的建立至關(guān)重要。

Fig 7c-f

此外迈嘹，在Jin668的薄壁組織模塊中削彬，STM與和與生長(zhǎng)素相關(guān)的LBD25存在共表達(dá)（Fig 7c），這再次暗示著Jin668和TM-1存在不同的生長(zhǎng)素極性網(wǎng)絡(luò)秀仲。

在Jin668的初生木質(zhì)部中融痛，WOX13和DTA4共同表達(dá)，而在TM-1中則不存在共表達(dá)（Fig 7d）神僵。

與生長(zhǎng)素運(yùn)輸相關(guān)的基因AUX1雁刷、LAX2以及WAT1在Jin668的形成層細(xì)胞中處于同一共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中（Fig 7e）。在TM-1的相同細(xì)胞類(lèi)型中保礼，LAX2和與生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸相關(guān)的基因MDR1位于同一共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中（Fig 7f）沛励。這些數(shù)據(jù)表明责语，在Jin668和TM-1中，不同的基因參與了生長(zhǎng)素的調(diào)控目派，進(jìn)一步證明了Jin668和TM-1細(xì)胞在組織培養(yǎng)過(guò)程中具有不同的生長(zhǎng)素運(yùn)輸特性坤候，這與不同的細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)。

結(jié)論8?通過(guò)CRISPR/Cas9基因敲除和過(guò)表達(dá)驗(yàn)證三個(gè)候選基因

Fig 9a-c

整合上述分析企蹭，作者挖掘到一系列潛在的促進(jìn)再生的基因白筹，最終選取了GhLAX1、GhLAX2和GhLOX3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證谅摄。

為了研究LAX在棉花再生中的作用徒河，作者創(chuàng)建了GhLAX1的CRISPR/Cas9敲除系（CR1）和GhLAX2的過(guò)表達(dá)系（OE1，F(xiàn)ig 9a）送漠。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后虚青，下胚軸外植體的兩端開(kāi)始擴(kuò)展。組織切片顯示螺男，空載對(duì)照組織（P7N）的初生導(dǎo)管組織細(xì)胞明顯大于基因敲除組織（Fig 9b）。與JP7N（Jin668 P7N對(duì)照）和TP7N（TM-1 P7N對(duì)照）相比纵穿，JCR1（Jin668 CR1敲除）和TCR1（TM-1 CR1敲除）外植體的初生導(dǎo)管組織細(xì)胞增殖明顯受抑制下隧，誘導(dǎo)10天后，初生導(dǎo)管組織產(chǎn)生的愈傷組織顯著少于對(duì)照谓媒。相反淆院，過(guò)表達(dá)植株JOE1（Jin668 OE1）和TOE1（TM-1 OE1）顯示出明顯的初生導(dǎo)管組織細(xì)胞增殖（Fig 9b）。

雖然所有外植體在誘導(dǎo)20天后都產(chǎn)生了愈傷組織（Fig 9c）句惯，但愈傷組織的增殖率（CPR）在20天的誘導(dǎo)后表現(xiàn)出顯著的差異：JCR1的CPR為58%土辩，JOE1為130%，與Jin668中的對(duì)照組（88%）顯著不同（t檢驗(yàn)抢野，P < 0.05）拷淘，這表明這些LAX基因可能在Jin668的愈傷組織增殖中發(fā)揮重要作用。

Fig 9d-f

誘導(dǎo)約70天后指孤，TOE1和JOE1產(chǎn)生了軟黃色的愈傷組織启涯，該愈傷組織中的細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞質(zhì)濃密恃轩，這是胚胎形成性棉花愈傷組織的典型特征结洼。與對(duì)照外植體（JP7N）相比，TOE1和JOE1都產(chǎn)生了更多的胚胎愈傷組織叉跛。然而松忍，JCR1和TCR1的大部分愈傷組織都是硬的且呈綠色，愈傷組織細(xì)胞形狀不規(guī)則筷厘、細(xì)胞質(zhì)較薄鸣峭，這與TP7N對(duì)照愈傷組織有很大不同（Fig 9d）進(jìn)一步宏所，作者統(tǒng)計(jì)了這些轉(zhuǎn)基因材料體外細(xì)胞胚胎形成的時(shí)間。與對(duì)照相比叽掘，過(guò)表達(dá)材料可以在較短時(shí)間內(nèi)直接從愈傷組織中誘導(dǎo)體外細(xì)胞胚胎楣铁，且體外細(xì)胞胚胎的形態(tài)正常（Fig 9e-f）。

機(jī)械損傷是愈傷組織誘導(dǎo)的一個(gè)觸發(fā)因素更扁，而植物激素茉莉酸（JA）是植物對(duì)環(huán)境脅迫作出反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子盖腕。作者發(fā)現(xiàn)一個(gè)參與JA生物合成的酶的編碼基因LOX3，在Jin668中特異性表達(dá)而在TM-1中未表達(dá)浓镜。在Jin668中敲除GhLOX3（CR2）會(huì)減少原始導(dǎo)管組織的增殖溃列，但與對(duì)照組P7N相比，無(wú)論是在Jin668還是在TM-1中膛薛，CPR并沒(méi)有顯著減少（Fig 9b-c）听隐。這意味著GhLOX3和JA在愈傷組織誘導(dǎo)中可能發(fā)揮了較小的作用，而LAX基因通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素運(yùn)輸對(duì)胚胎潛能有更大的影響哄啄。

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