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癌癥服球，一種慢性的基因病茴恰。

簡介

在癌癥研究中，每個癌癥樣品呈現(xiàn)在研究人員眼前的已經(jīng)是一個發(fā)生了改變的基因組斩熊，其中包含著獨特且難以預(yù)測的諸多點突變往枣、序列的插入缺失、易位粉渠、融合以及其他畸變分冈。并且，這些發(fā)生的變異中霸株，許多往往都是之前所未觀察到的（Novel mutations）雕沉，它們也不會只存在于基因組的編碼區(qū)域中，因而為了能夠真正做到全面研究癌癥基因組本身所發(fā)生的所有突變事件去件，全基因組測序已被視為腫瘤基因變異研究中 唯一 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒ā?/p>

然而坡椒，在所有這些變異中，卻只有少數(shù)的幾個主導(dǎo)著癌癥這一疾病的發(fā)展和演變尤溜。要有效揭示這一演變和發(fā)展的過程倔叼，就需要監(jiān)控基因表達(dá)水平上的變化，那么RNA-Seq便是用以確定這些遺傳改變是否會影響疾病發(fā)展有用技術(shù)宫莱。但遺傳改變有可能影響所有的細(xì)胞過程丈攒，包括染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA甲基化授霸、RNA剪接異構(gòu)體巡验、RNA編輯和microRNA（miRNA）等。這就意味著碘耳，只有對所有這些獨立的過程都進(jìn)行檢測和綜合分析显设，才能在癌癥研究中取得真正的突破。這些內(nèi)容我們都將在下文一一展開藏畅。

當(dāng)前基因組測序技術(shù)的一大特點是在于能夠在很短的時間內(nèi)并行測得數(shù)十億（甚至數(shù)百億）的獨立序列片段——read敷硅，而每個read來源于單個的DNA分子。由此產(chǎn)生的數(shù)據(jù)我們可將其視為是對DNA分子的隨機(jī)抽樣愉阎，這反過來代表腫瘤樣品中每個細(xì)胞的基因組的情況绞蹦。這是我們解開癌癥的原因和機(jī)制的一種強(qiáng)大工具。

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腫瘤異質(zhì)性

癌癥基因組的突變是復(fù)雜的榜旦。

每個人都攜帶一套獨特的來自父母遺傳的胚系突變（germline mutations）信息幽七。但隨著癌癥的發(fā)展，體細(xì)胞突變（Somatic mutations）和基因組重排（genomics rearrangements）會逐漸增加溅呢。這些改變往往會引發(fā)耐藥性以及轉(zhuǎn)移澡屡。越來越多的研究證據(jù)表明，這些過程竟然可以是 有意的咐旧！——它們其實可以認(rèn)為是癌細(xì)胞面臨藥物刺激的過程中不斷進(jìn)化的結(jié)果驶鹉。我們想要全面地理解這一復(fù)發(fā)和耐藥性的原因，就有必要進(jìn)行縱向?qū)嶒炏衬凑瞻┌Y的發(fā)展過程室埋，分階段采集樣品來進(jìn)行研究。

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如上圖伊约，這是處于正常組織背景下的多克隆腫瘤（polyclone tumor）姚淆。大多數(shù)的腫瘤樣品都會同時包含腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，如基質(zhì)細(xì)胞屡律、血管和免疫細(xì)胞腌逢。并且腫瘤本身也常常包含幾種不同的克隆亞型（clone types），每一種都有著不同的治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)可能超埋。

根據(jù)傳統(tǒng)病理學(xué)的估計搏讶，大部分研究的結(jié)果其實都只集中在那些腫瘤細(xì)胞比例 >60% 的區(qū)域中。并且為了確定哪些突變是腫瘤特異的霍殴，通常都要包含來自同一個體的正常組織樣本作為參考窍蓝。

然而，腫瘤本身也往往是異質(zhì)性的繁成。在癌癥發(fā)展的過程中吓笙，個別細(xì)胞會發(fā)生新的突變，包含這些新突變的細(xì)胞會繼續(xù)增殖巾腕，形成克隆亞型面睛。因此，對于晚期癌癥我們通常檢測到的都是一個多克隆腫瘤尊搬，其中每一個克隆有一套獨特的突變信息叁鉴、獨特的病理學(xué)和藥物反應(yīng)機(jī)制。這其實也正是癌癥難以完全治療的原因佛寿，而它的這種 異質(zhì)性其實正是腫瘤基因組復(fù)雜性導(dǎo)致的一種表型性質(zhì)幌墓。目前的深度測序可以檢測樣本中含量低至1%的克隆但壮。

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腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。體細(xì)胞突變的逐步累積產(chǎn)生了一個異質(zhì)的多克隆腫瘤常侣，其中不同克隆可能對治療的反應(yīng)不同蜡饵。

而且，異質(zhì)性一般還可以分兩種情況討論胳施，第一種情況指的是：同一個病人的腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性溯祸。處于腫瘤發(fā)生的不同時期的腫瘤細(xì)胞的基因突變情況不同，造就了每一個腫瘤細(xì)胞群體內(nèi)還有許多亞群（subclones）舞肆，腫瘤細(xì)胞在通過轉(zhuǎn)移時焦辅，就會有屬于不同亞群的腫瘤細(xì)胞去侵入新的地方，形成新的腫瘤椿胯；第二種情況指的是：除了同一病人的不同腫瘤細(xì)胞會造成腫瘤的異質(zhì)性外筷登，腫瘤的異質(zhì)性還體現(xiàn)在不同病人可能得了相同的腫瘤，但是那個『相同』未必真是相同——僅僅是表型相同哩盲，不代表著基因型也相同仆抵。

在某些基因中，突變頻繁發(fā)生在同一個位置种冬，這應(yīng)該有特定的機(jī)制在起作用镣丑，這些有規(guī)律性的情況都會稍微容易對付。然而遺憾的是娱两，對于大多數(shù)的基因莺匠，突變顯然是隨機(jī)出現(xiàn)在整個基因中的，這其實說明了DNA的復(fù)制和修復(fù)機(jī)制失靈了十兢。

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參考文獻(xiàn)

2012年Ding Li等人發(fā)表在Natrue上的一項研究弄清了急性髓細(xì)胞白血不С印（AML）的復(fù)發(fā)原因。他們發(fā)現(xiàn)了兩個一般機(jī)理：（1）原發(fā)腫瘤中的始發(fā)克麓（founding clone）獲得突變鸡号，進(jìn)化成復(fù)發(fā)克隆须鼎；（2）始發(fā)克隆的一個亞克隆挺過了初次治療鲸伴，獲得了更多突變并在復(fù)發(fā)時增殖府蔗。在一個病例中，原發(fā)腫瘤里原本僅占5.1%的亞克隆在復(fù)發(fā)后卻成長為主要的克隆汞窗。而且對于所有的病例姓赤，化療并不能夠根除這些始發(fā)克隆。這項研究直接表明了在診斷后和初次治療后檢測并根除掉那些原本不起眼的小細(xì)胞群體有多么的重要杉辙！
Ding L., Ley T. J., Larson D. E., Miller C. A., Koboldt D. C., et al. (2012) Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature 481: 506-510

同樣是2012年，同樣是Ding Li這波人捶朵，同樣是研究AML蜘矢，他們這次發(fā)現(xiàn)大約三分之一的骨髓增生異常綜合征患者會發(fā)展成繼發(fā)性急性髓細(xì)胞白血病(AML)。這個研究的目的是為了確定骨髓增生異常綜合征中的突變综看，它們有可能預(yù)測AML的進(jìn)展品腹。他們對七名繼發(fā)性AML患者的七組皮膚和骨髓樣品以及先前的骨髓增生異常綜合征的配對骨髓樣品一并做了全基因組測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)红碑，在所有病例中舞吭，占主導(dǎo)地位的繼發(fā)性AML克隆都是來自一個骨髓增生異常綜合征的始發(fā)克隆。這其實就是說析珊，骨髓增生異常綜合征樣品包含了對預(yù)后很重要的突變羡鸥，針對這些突變的治療方案是可能改善預(yù)后的。
Walter M. J., Shen D., Ding L., Shao J., Koboldt D. C., et al. (2012) Clonal architecture of secondary acute myeloid leukemia. N Engl J Med 366: 1090-1098

繼續(xù)腫瘤治療和預(yù)后的話題忠寻，Gerlinger M這一波人發(fā)起了一項研究惧浴，利用全外顯子組測序來研究多個樣品，這些樣品不僅來自兩名患者體內(nèi)的原發(fā)腎癌奕剃，還包括了患者相關(guān)轉(zhuǎn)移部位的空間分隔區(qū)域衷旅。最后，他們在原發(fā)腫瘤中看到了廣泛存在的異質(zhì)性現(xiàn)象纵朋！而且還特別指出了在每個腫瘤區(qū)域內(nèi)有63%-69%的體細(xì)胞突變是無法檢測到的柿顶。同時，還檢測了同一腫瘤不同區(qū)域內(nèi)預(yù)后良好和不良的基因表達(dá)特征操软。這其實還是突出了在突變積累之前早期診斷的重要性嘁锯，以及對較大腫瘤需要進(jìn)行多個部位的活檢。利用同一名患者的多個樣本得到的信息聂薪，他們能夠重建疾病的發(fā)展進(jìn)程猪钮！這是一種極為強(qiáng)大的方法，不僅能檢測引發(fā)事件胆建，還能檢測表現(xiàn)出平行進(jìn)化的基因烤低。平行進(jìn)化通常是基因在進(jìn)化壓力下的一種表現(xiàn)，其實也表示那些基因可能成為有效的治療靶點笆载。
Gerlinger M., Rowan A. J., Horswell S., Larkin J., Endesfelder D., et al. (2012) Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 366: 883- 892扑馁。

轉(zhuǎn)移

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程涯呻，其中癌細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤，通過血液或者淋巴系統(tǒng)循環(huán)到身體的其他部位腻要。在新部位复罐，細(xì)胞繼續(xù)繁殖，最終形成更多腫瘤雄家，這些腫瘤包含了反映其組織來源的細(xì)胞效诅。腫瘤（胰腺癌和葡萄膜腫瘤）轉(zhuǎn)移的能力大大增加了它們的致死性。關(guān)于轉(zhuǎn)移腫瘤的克隆結(jié)構(gòu)趟济、轉(zhuǎn)移酶之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系乱投、轉(zhuǎn)移和原發(fā)部位的平行進(jìn)化規(guī)模，腫瘤如何擴(kuò)散顷编，以及腫瘤微環(huán)境在轉(zhuǎn)移部位決定中的作用如何等戚炫，許多這些基本問題目前仍然沒有很好地解決。

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轉(zhuǎn)移瘤可能來源于原發(fā)腫瘤中一個主要克孪蔽场（如上圖：Metastasis1）双肤，也可能來源于次要克隆（Metastasis2）钮惠。轉(zhuǎn)移瘤也會經(jīng)歷克隆進(jìn)化（如Metastasis1所示）

參考文獻(xiàn)

Hsieh A. C., Liu Y., Edlind M. P., Ingolia N. T., Janes M. R., et al. (2012) The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature 485: 55-61

這篇文章證明了前列腺癌基因組經(jīng)由致癌mTOR通路的特殊翻譯機(jī)制茅糜，這其中產(chǎn)生了一個特定的基因群，它們參與了細(xì)胞增殖素挽、代謝和侵襲限匣。隨后作者對一類翻譯控制前侵襲信使RNA進(jìn)行了功能鑒定，并指出了這些mRNA主導(dǎo)了癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移毁菱。

基因組突變

所有的腫瘤在其發(fā)展的過程中都會不斷積累體細(xì)胞突變（somatic mutations）米死。大多數(shù)常見的腫瘤與不同的癌基因相關(guān)聯(lián)，這些癌基因以低頻率發(fā)生突變贮庞。從大型癌癥數(shù)據(jù)庫中觀察到的一個最令人驚訝的現(xiàn)象是癌癥間甚至各個癌癥類型內(nèi)的顯著遺傳異質(zhì)性峦筒。然而，似乎只有有限的細(xì)胞通路對腫瘤的細(xì)胞生物學(xué)很重要窗慎。目前很多人正在編輯收錄各種癌癥類型的體細(xì)胞突變綜合列表物喷，這對于更好地了解這種疾病背后的機(jī)制將有很大的指引作用。

研究參考

Nik-Zainal S., Alexandrov L. B., Wedge D. C., Van Loo P., Greenman C. D., et al. Mutational processes molding the genomes of 21 breast cancers. Cell 149: 979-993
這篇文章中研究了21個乳腺癌基因組遮斥，并給出了它的一個體細(xì)胞突變列表峦失。發(fā)現(xiàn)帶BRCA1或者BRCA2突變的癌癥會有一種特別的替換突變特征和與眾不同的缺失圖譜。文章中還描述了一種局部的超突變現(xiàn)象术吗，這稱為『kataegis』(kataegis尉辑，希臘語中『雷雨』的意思，文中指的是在一個小區(qū)域中出現(xiàn)大量突變的機(jī)制较屿，如下圖)隧魄。并且這些區(qū)域中的堿基替換幾乎都發(fā)生在TpC二核苷酸的胞嘧啶上卓练！

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這是Kataegis圖像」鹤模縱軸是突變間距（對數(shù)刻度）襟企。這個圖中基因組內(nèi)大部分的突變都有著

106bp 106bp

至

106bp 106bp

的突變距離。其中超突變區(qū)即是表現(xiàn)為突變間距較低的簇狮含。

Govindan R., Ding L., Griffith M., Subramanian J., Dees N. D., et al. Genomic landscape of non-small cell lung cancer in smokers and never-smokers. Cell 150: 1121-1134
這是另一篇文章顽悼，主要是對17個非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的肺癌及癌旁正常組織樣本進(jìn)行了全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序。值得注意的是吸煙者中所觀察到的突變頻率比不吸煙者高10倍几迄！這是通過深度測序揭示出的這些群體間所不同的克隆模式蔚龙。而且其中所有經(jīng)過驗證的EGFR和KRAS突變都存在于原始克隆中，這其實也就表明了它們在癌癥啟動中可能發(fā)揮非常重要的作用乓旗。

鑲嵌性

對于這個現(xiàn)象我們也同樣通過實際的研究來說明府蛇。AML（急性髓細(xì)胞白血布鳌）基因組中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)突變實際上是隨機(jī)事件屿愚，在造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞（HSPC）獲得原始突變之前就存在了；但是隨著克隆的擴(kuò)增务荆，細(xì)胞的突變歷史被『捕獲』了妆距。如何理解這里的『捕獲』？其實說的就是函匕，原本那些突變都沒什么鳥用娱据，就擺在那無所事事，但是盅惜，在許多情況下中剩，偏偏只需要再來一個或者兩個額外的突變來協(xié)助就能共同作用，最后產(chǎn)生惡性的原始腫瘤克率慵拧结啼！

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原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移的鑲嵌性。非同義點突變和插入缺失（綠色塊）的區(qū)域分布的假設(shè)熱圖屈芜。行代表來自七個原發(fā)腫瘤區(qū)域和六個轉(zhuǎn)移區(qū)域的樣品郊愧。

研究參考

Abyzov A., Mariani J., Palejev D., Zhang Y., Haney M. S., et al. (2012) Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature 492: 438-442
這里作者發(fā)現(xiàn)了一個現(xiàn)象：平均而言，iPSC細(xì)胞系表現(xiàn)出2個拷貝數(shù)變異（CNV）井佑，而這些CNV在iPSC來源的成纖維細(xì)胞中不明顯属铁。他們發(fā)現(xiàn)，至少50%的CNV以低頻體細(xì)胞變異存在于親本的成纖維細(xì)胞中躬翁。根據(jù)這一觀察焦蘑，他們估計大約30%的成纖維細(xì)胞的基因組中攜帶體細(xì)胞CNV，這表明體細(xì)胞鑲嵌性廣泛存在于人體中盒发。

基因融合

基因融合是非常普遍的喇肋，也是癌癥的一個重要特征》厍現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，一個強(qiáng)啟動子與一個下游功能基因（比如：原癌基因）的融合在某些癌癥中很普遍蝶防。據(jù)估計甚侣，半數(shù)的前列腺癌含有TMPRSS2和ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員之間的融合〖溲В基因融合是由兩個原本分開的基因或位點融合形成的殷费。他們可能形成一種基因產(chǎn)物，很多時候表現(xiàn)出來的功能都是全新的低葫，與兩個融合的基因個體都不同详羡。這種陰差陽錯的情況可能引起致癌機(jī)制的激活告喊，就像費城染色體陽性急性淋巴細(xì)胞白血病一樣酱酬。這種基因融合導(dǎo)致BCR-ABL酪氨酸激酶表達(dá)，從而激活細(xì)胞增殖拯杠。有幾種機(jī)制會導(dǎo)致基因融合的發(fā)生善涨，這個現(xiàn)象是一些癌癥類型的特點窒盐。胰腺癌的特點便是染色體重排的頻繁斷裂-融合-橋循環(huán)。目前有幾種方法可以通過測序研究融合事件钢拧，如對腫瘤的全基因組測序和mRNA-Seq蟹漓。

mRNA-Seq與全基因組測序組合的方法對于發(fā)現(xiàn)基因融合及其機(jī)制特別高效。原因就是mRNA-Seq可以提供直接的證據(jù)源内，來支持觀察到的融合是否發(fā)生葡粒，并同時為融合基因是否表達(dá)提供了證據(jù)。而全基因組測序可以發(fā)現(xiàn)那些mRNA-Seq所發(fā)現(xiàn)不了的區(qū)域的信息膜钓，如基因間區(qū)和UTR嗽交。

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由折回倒位所引起的融合事件可捕獲基因組中遙遠(yuǎn)區(qū)域的片段，如著絲粒重復(fù)或參與體細(xì)胞重排的區(qū)域颂斜。在這個例子中夫壁，6號染色體上的片段被插入到19號染色體上的重復(fù)區(qū)域之間。注意19號染色體的第二個拷貝是倒置的焚鲜，這是折回倒位的特點掌唾。

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MED1（紅色）與幾個伙伴基因（藍(lán)色）：ACSF2，USP32 和 STXBP4形成基因融合忿磅。

實驗上的設(shè)計參考

以Pair-end進(jìn)行全基因組測序是目前檢測基因融合最準(zhǔn)確糯彬、最全面的工具，這些融合包括重復(fù)葱她、倒位撩扒、通讀和單堿基插入缺失。可以說Pair-end是檢測融合基因成功與否的一個關(guān)鍵因素搓谆。
另外就是高深度測序結(jié)合更長的讀長可以分辨融合連接中微同源的單堿基炒辉。而且這種能力是測序獨有的。

研究參考

Robinson D. R., Wu Y. M., Kalyana-Sundaram S., Cao X., Lonigro R. J., et al. Identification of recurrent NAB2-STAT6 gene fusions in solitary fibrous tumor by integrative sequencing. Nat Genet 45: 180-185
文章主要是利用了全外顯子組和轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄抑制因子NAB2與轉(zhuǎn)錄激活因子STAT6的基因融合現(xiàn)象泉手。其中27個獨立性纖維性腫瘤（SFT）的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)所有腫瘤中存在NAB2-STAT6基因融合黔寇。NAB2-STAT6基因融合的過表達(dá)誘導(dǎo)了培養(yǎng)細(xì)胞的增殖，并激活了EGR應(yīng)答基因的表達(dá)斩萌，最后導(dǎo)致了腫瘤缝裤。

Seshagiri S., Stawiski E. W., Durinck S., Modrusan Z., Storm E. E., et al. Recurrent R- spondin fusions in colon cancer. Nature 488: 660-664
這一篇文章則主要分析了70個原發(fā)性人結(jié)腸癌的外顯子組、轉(zhuǎn)錄組和拷貝數(shù)變異颊郎”锓桑拷貝數(shù)和RNA-Seq的數(shù)據(jù)分析確定了在一部分結(jié)直腸癌中存在IGF2的擴(kuò)增和相應(yīng)過表達(dá)。他們還利用RNA-Seq姆吭，在10%的結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)了與R-脊椎蛋白家族成員（RSPO2和RSPO3）相關(guān)的基因融合榛做。這項研究表明了綜合多項技術(shù)去了解復(fù)雜的癌癥基因組很重要。

Thompson-Wicking K., Francis R. W., Stirnweiss A., Ferrari E., Welch M. D., et al. (2012) Novel BRD4-NUT fusion isoforms increase the pathogenic complexity in NUT midline carcinoma. Oncogene
這篇文章則提到了PER-624中一種新的BRD4-NUT融合竟然編碼了一種功能蛋白内狸，并且它對這些細(xì)胞的致癌機(jī)制很關(guān)鍵检眯。BRD4-NUT融合轉(zhuǎn)錄本是通過易位后的RNA剪接而產(chǎn)生的，這似乎是這些癌癥的一個共同特征答倡。這種有助于融合基因的替代異構(gòu)體表達(dá)的機(jī)制是第一次報道轰传。

Wen H., Li Y., Malek S. N., Kim Y. C., Xu J., et al. (2012) New fusion transcripts identified in normal karyotype acute myeloid leukemia. PLoS ONE 7: e51203
在這項研究中驴党，作者運用雙端RNA-Seq來發(fā)現(xiàn)染色體核型中的融合瘪撇，它們經(jīng)傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析未檢測到異常。他們發(fā)現(xiàn)了臨近基因間的融合轉(zhuǎn)錄本以及7個只存在于正常核型中的融合本港庄。

染色體碎裂

這是一個不希望發(fā)生的現(xiàn)象倔既，染色體碎裂是一個一次性的細(xì)胞危機(jī)，在單次事件中發(fā)生數(shù)十次至數(shù)百次基因組重排鹏氧。這種災(zāi)難性事件的后果是復(fù)雜的局部重排和拷貝數(shù)變異渤涌，其中染色體上2個（偶爾3個）拷貝的有限范圍可被檢測。這種單次災(zāi)難性事件的模式不同于癌癥發(fā)展的逐步積累突變的典型模式把还。在突變積累的癌癥發(fā)展模式中实蓬，拷貝數(shù)無上限，因此通常有一個較大的范圍吊履。據(jù)估計安皱，在所有癌癥及其不同亞型之間，染色體碎裂的發(fā)生概率約2-3%艇炎，而在骨癌中發(fā)生概率則大約25%酌伊。

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染色體碎裂的圖示。

研究參考

Rausch T., Jones D. T., Zapatka M., Stutz A. M., Zichner T., et al. (2012) Genome Sequencing of Pediatric Medulloblastoma Links Catastrophic DNA Rearrangements with TP53 Mutations. Cell 148: 59-71

文章提到一名Sonic-Hedgehong髓母細(xì)胞瘤（SHH-MB）患者的大量缀踪、復(fù)雜的染色體重排居砖，此患者帶有生殖細(xì)胞系TP53突變（Li-Fraumeni綜合征）虹脯。同時將規(guī)模擴(kuò)大到11名Li-Fraumeni綜合征患者的篩查，發(fā)現(xiàn)有36%的腫瘤表現(xiàn)出與染色體碎裂一致的重排奏候。這比一般腫瘤群體所觀察到的2%染色體碎裂發(fā)生率要高得多循集。P53的生殖細(xì)胞系突變與一些腫瘤中凋亡中止導(dǎo)致染色體碎裂的假說是一致的。

拷貝數(shù)變異（CNV）

結(jié)構(gòu)性變異影響基因量——可轉(zhuǎn)錄基因的功能拷貝數(shù)蔗草。腫瘤發(fā)展暇榴、藥物反應(yīng)及耐藥性的發(fā)生通常是由基本的基因擴(kuò)增和刪除來驅(qū)動的。這些基因組上的改變可分成大的畸變和小的畸變蕉世。大的畸變包括整個染色體或部分染色體的丟失或重復(fù)蔼紧，這被稱為非整倍體。小的畸變可能只包含一個堿基狠轻，比如點突變和小片段的插入缺失奸例。與健康的基因組不同，這些基因表達(dá)的改變會受到轉(zhuǎn)錄因子的嚴(yán)格調(diào)控向楼，癌癥基因組則通過基因的重復(fù)和刪除來適應(yīng)和逃避這種調(diào)控查吊。癌癥耐藥性的發(fā)生正是此反應(yīng)的速度和效率的絕佳證明。

基因表達(dá)

基因表達(dá)分析測定基因轉(zhuǎn)錄湖蜕、RNA加工和表觀遺傳控制的產(chǎn)物逻卖。因此，基因表達(dá)分析不僅可以看出這些過程的『健康』程度昭抒，也可以深入研究細(xì)胞里面的分子機(jī)制评也。基于芯片的mRNA分析曾在癌癥的基因變得研究中廣泛使用灭返，但基于測序的mRNA分析（mRNA-Seq）的出現(xiàn)代表我們測定和解析基因表達(dá)產(chǎn)物能力的又一次飛躍盗迟。mRNA-Seq可檢測修飾過的RNA和表達(dá)水平極低的RNA的能力讓它特別適合癌癥研究∥鹾基于mRNA-Seq的方法也可檢測非撤Ｂ疲快的轉(zhuǎn)錄變化、剪接異構(gòu)體怎静、融合基因以及可變聚腺苷酸化位點邮弹。

table

Feng H., Qin Z. and Zhang X. (2012) Opportunities and methods for studying alternative splicing in cancer with RNA-Seq. Cancer Lett
這篇綜述關(guān)注了RNA-Seq在研究癌癥相關(guān)的可變剪切中的應(yīng)用。文中包含一個生物信息學(xué)工具列表蚓聘，以及有關(guān)估計可變剪切異構(gòu)體的表達(dá)水平的詳盡討論腌乡。

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利用RNA-Seq研究癌癥中基因表達(dá)和選擇性剪接的典型生物信息學(xué)流程。首先或粮，將短read定位到參考基因組或轉(zhuǎn)錄組导饲。在定位之后，估算注釋基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)與剪接。

van Delft J., Gaj S., Lienhard M., Albrecht M. W., Kirpiy A., et al. (2012) RNA-Seq provides new insights in the transcriptome responses induced by the carcinogen benzo[a]pyrene. Toxicol Sci 130: 427-439

作者發(fā)現(xiàn)渣锦，RNA-Seq所檢測到的基因比芯片技術(shù)多約20%硝岗，而表達(dá)差異明顯的基因更是接近三倍之多。因此袋毙，他們檢測到的受影響的通路和生物學(xué)機(jī)制達(dá)2-5倍型檀。作者還在許多基因中發(fā)現(xiàn)了可變異構(gòu)體的表達(dá)，包括細(xì)胞死亡和DNA修復(fù)的調(diào)控因子听盖，如TP53胀溺、BCL2和XPA，它們與基因毒性反應(yīng)相關(guān)皆看。他們還發(fā)現(xiàn)了功能未知的新亞型仓坞，如已知轉(zhuǎn)錄本的片段、帶有額外外顯子的轉(zhuǎn)錄本腰吟、內(nèi)含子保留或外顯子跳躍事件无埃。

Kaur H., Mao S., Li Q., Sameni M., Krawetz S. A., et al. (2012) RNA-Seq of human breast ductal carcinoma in situ models reveals aldehyde dehydrogenase isoform 5A1 as a novel potential target. PLoS ONE 7: e50249
作者將三個DCIS模型（MCF10.DCIS、SUM102和SUM225）的表達(dá)與三維（3D）覆蓋培養(yǎng)的非致癌乳腺上皮細(xì)胞的MCF10A模型進(jìn)行了比較毛雇，確定了DCIS模型共用的表達(dá)變化嫉称。他們發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的基因編碼了與多個信號通路相關(guān)的蛋白灵疮。

Meyer J. A., Wang J., Hogan L. E., Yang J. J., Dandekar S., et al. (2013) Relapse-specific mutations in NT5C2 in childhood acute lymphoblastic leukemia. Nat Genet 45: 290-294

作者利用RNA測序织阅，報道了診斷和復(fù)發(fā)相配對的骨髓標(biāo)本的轉(zhuǎn)錄本圖譜，這些標(biāo)本來自十名患有小兒B淋巴細(xì)胞白血病的個體震捣。轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出20個新獲得的突變荔棉，它們不存在于最初的診斷中，而2名個體帶有復(fù)發(fā)特異的突變伍派。帶有NT52C2突變的所有個體都在初步診斷后36個月內(nèi)復(fù)發(fā)江耀。

實驗設(shè)計上的注意事項

RNA-Seq已成為一種研究腫瘤分子變化的常規(guī)應(yīng)用剩胁，大部分研究人員采用生產(chǎn)商的試驗流程诉植。rRNA的去除可提高信噪比，實現(xiàn)低表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的檢測昵观。

癌癥中的體細(xì)胞突變基本上是 de novo晾腔。測序不需要關(guān)于突變的先驗知識，即可準(zhǔn)確定位突變以及得到轉(zhuǎn)錄本豐度啊犬。

腫瘤通常包含各種細(xì)胞灼擂。mRNA-Seq的可延伸檢測范圍和準(zhǔn)確性對檢測微小的表達(dá)變化非常寶貴。只要腫瘤轉(zhuǎn)錄本包含了獨特的體細(xì)胞突變或剪接變異體觉至，那么就可將它與正常的細(xì)胞區(qū)分開來剔应。

二代雙端對讀測序檢測基因融合的靈敏度取決于許多因素，包括表達(dá)水平、轉(zhuǎn)錄本長度峻贮、所使用的樣品制備方法以及cDNA文庫的片段長度席怪。

大部分實驗方案采用poly（A）富集的RNA制備方法來測定mRNA水平。然而纤控，非編碼RNA挂捻，如miRNA，也在細(xì)胞的生物學(xué)中發(fā)揮重要作用船万，并常常介導(dǎo)對腫瘤生長和存活很關(guān)鍵的過程刻撒。非編碼RNA可通過現(xiàn)有的poly(A)-(rRNA去除)實驗方案輕松分析。

RNA表達(dá)是組織和細(xì)胞類型特異的耿导。在選擇腫瘤-正常對照中的對照時声怔，應(yīng)考慮這一點。

選擇性剪接

癌癥的生物起源舱呻、發(fā)展捧搞、轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)錄組中的許多變異相關(guān)聯(lián)。癌癥特異的選擇性剪接是個普遍存在的現(xiàn)象狮荔，也是個主要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制胎撇，涉及到許多癌癥類型。

Seo J. S., Ju Y. S., Lee W. C., Shin J. Y., Lee J. K., et al. (2012) The transcriptional landscape and mutational profile of lung adenocarcinoma. Genome Res 22: 2109-2119
作者分析了韓國200個肺腺癌殖氏。他們在LMTK2晚树、ARID1A、NOTCH2和SMARCA4中發(fā)現(xiàn)了新的驅(qū)動突變雅采。他們還發(fā)現(xiàn)了45個融合基因爵憎，其中8個是嵌合的絡(luò)氨酸激酶。在17個反復(fù)發(fā)生的選擇性剪接事件中婚瓜，原癌基因MET中的第14號外顯子跳過可能是癌癥驅(qū)動因素宝鼓。這項研究表明了這種癌癥的復(fù)雜性以及運用幾種技術(shù)的價值。

Liu J., Lee W., Jiang Z., Chen Z., Jhunjhunwala S., et al. (2012) Genome and transcriptome sequencing of lung cancers reveal diverse mutational and splicing events. Genome Res 22: 2315- 2327
作者對19個肺癌細(xì)胞系和3組肺部腫瘤/正常樣本配對開展了全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序巴刻。他們鑒定出106個與癌癥特異性的異常剪接相關(guān)的剪接位點突變愚铡，包括一些已知的癌癥相關(guān)基因中的突變。RAC1b是RAC1 GTP酶的一個異構(gòu)體胡陪，含有一個額外的外顯子沥寥，被認(rèn)為在肺癌中優(yōu)先上調(diào)，并對MAP2K（MEK）抑制劑PD-0325901敏感柠座。

Thompson-Wicking K., Francis R. W., Stirnweiss A., Ferrari E., Welch M. D., et al. (2012) Novel BRD4-NUT fusion isoforms increase the pathogenic complexity in NUT midline carcinoma. Oncogene
這篇文章發(fā)現(xiàn)了PER-624中一種新的BRD4-NUT基因融合編碼了一種功能蛋白邑雅，它對這些細(xì)胞的致癌機(jī)制很關(guān)鍵。BRD4-NUT融合轉(zhuǎn)錄本是通過易位后的RNA剪接而產(chǎn)生的妈经，這似乎是這些癌癥的一個共同特征淮野。這種現(xiàn)象以及促進(jìn)融合基因的可變異構(gòu)體表達(dá)的機(jī)制捧书，過去一直未被發(fā)現(xiàn)。

RNA編輯

在我們?nèi)梭w中骤星，DNA和RNA序列之間的差異也被稱之為 RNA編輯鳄厌，這是一種廣泛存在的現(xiàn)象。最頻繁的RNA編輯類型是通過腺苷脫氨酶作用于RNA(ADAR)從而實現(xiàn)由腺苷到肌苷的轉(zhuǎn)換妈踊。然后緊接著了嚎，剪接和翻譯機(jī)制會將肌識別為鳥苷。在一些腫瘤基因組比正忱扔基因組有著更更比例的RNA-DNA差異歪泳。

Jiang Q., Crews L. A., Barrett C. L., Chun H. J., Court A. C., et al. (2013) ADAR1 promotes malignant progenitor reprogramming in chronic myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 110: 1041-1046
作者發(fā)現(xiàn)，慢性髓細(xì)胞白血病(CML)急變期的祖細(xì)胞有著更高的IFN-r通路基因表達(dá)以及BCR-ABL擴(kuò)增露筒。在CML發(fā)展期間呐伞，他們還發(fā)現(xiàn)IFN應(yīng)答的ADAR1 p150亞型的表達(dá)增強(qiáng)，并且腺苷-肌苷的RNA編輯增加慎式。

MicroRNA和非編碼RNA

MicroRNA(miRNA)的長度很短伶氢，大小集中在17bp-25bp之間，屬于非編碼RNA（ncRNA）家族的成員瘪吏。它們調(diào)控多種不同的生物學(xué)功能癣防，包括發(fā)育、細(xì)胞增殖掌眠、細(xì)胞分化蕾盯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡蓝丙、代謝和細(xì)胞壽命级遭。

通過RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）與轉(zhuǎn)錄本的3-UTR或者與編碼區(qū)中的識別位點相互作用。miRNA的一個主要作用是抑制基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)渺尘。在多種癌癥中挫鸽，許多miRNA位于存在序列缺失刪除或擴(kuò)增的基因組區(qū)域，這表明它們很可能在癌癥的發(fā)展過程中扮演很重要的角色鸥跟。miRNA的編輯位點已經(jīng)在近年來的研究中被發(fā)現(xiàn)了丢郊，表明RNA編輯和miRNA介導(dǎo)的調(diào)控之間可能存在著關(guān)聯(lián)。同時由于miRNA的測定簡單锌雀、相對穩(wěn)定蚂夕，并且在大量mRNA的控制上起作用，這就讓miRNA成為癌癥診斷以及治療期間的檢測和分期過程中極具吸引力的標(biāo)志物腋逆。

Law P. T., Qin H., Ching A. K., Lai K. P., Co N. N., et al. (2013) Deep sequencing of small RNA transcriptome reveals novel non-coding RNAs in hepatocellular carcinoma. J Hepatol
這篇文章描述了一種新的PIWI-互作RNA(piRNA)piR-Hep1，它參與了肝臟腫瘤發(fā)展侈贷。與周圍正常肝臟相比惩歉，46.6%的肝癌細(xì)胞(HCC)存在piR-Hep1表達(dá)上調(diào)等脂。piR-Hep1的沉默抑制了細(xì)胞活力、運動和侵襲撑蚌。作者還發(fā)現(xiàn)miR-1323在HCC中的大量表達(dá)上遥，以及它與肝硬化背景下所產(chǎn)生的腫瘤的獨特關(guān)聯(lián)。

實驗設(shè)計上的注意事項

測序深度與檢測靈敏度是直接相關(guān)的争涌。在典型的實驗中粉楚，如果測序流動槽（Flowcell）的一條通道（lane）只上一個樣本，那么測序深度會非常高亮垫，這能實現(xiàn)極其靈敏的檢測模软。基于此原因饮潦，miRNA的測序深度很少成為考慮因素燃异。在篩查應(yīng)用中，或不需要如此高深度檢測的研究中继蜡，樣品可加上測序Index標(biāo)簽回俐，從而能夠在同一個測序lane中上樣多個不同的樣本。需要注意的是稀并，在設(shè)計miRNA的測序深度時仅颇，要時刻記住miRNA控制基因表達(dá)，因而miRNA水平的小變化可能影響許多編碼蛋白碘举。

新發(fā)現(xiàn)的miRNA應(yīng)當(dāng)通過功能分析(如Ago2結(jié)合或敲除實驗)來確認(rèn)灵莲。

實驗應(yīng)當(dāng)包含足夠的樣品，以便結(jié)論具有真正的統(tǒng)計意義和高的可信度殴俱。一般來說政冻，建立一個可能的假設(shè)相對來說是比較容易的，只要能證明miRNA存在于患者的腫瘤中线欲，即便樣本數(shù)量不多也是足夠的明场。但是要真正驗證假設(shè)就沒那么容易了，通常需要大量的患者來檢驗李丰，并建立統(tǒng)計學(xué)可信度苦锨。目前，關(guān)于如何在測序研究中建立統(tǒng)計學(xué)可信度和多重檢驗糾正趴泌，還沒有特別公認(rèn)的方法舟舒。當(dāng)前基于測序的miRNA分析并沒有實現(xiàn)miRNA表達(dá)的絕對定量，而僅是不同miRNA(如腫瘤-正常配對)的相對量嗜憔。

樣品分層是癌癥樣品的一個問題秃励。一個特定的癌癥表型可能代表幾種不同的病因和機(jī)理。為了要進(jìn)行嚴(yán)格的分析吉捶，應(yīng)當(dāng)有足夠多的樣品量夺鲜，從而能夠充分代表每個腫瘤亞型皆尔。而miRNA的表達(dá)會隨著腫瘤的發(fā)展而變化，因此在實驗設(shè)計時應(yīng)建立腫瘤分期和分級币励。

RNA-蛋白結(jié)合（CLIP-Seq）

在人類細(xì)胞中慷蠕，大多數(shù)mRNA(或前體mRNA)與核不均一性核糖蛋白(hnRNP)相結(jié)合，形成大的hnRNP-RNA復(fù)合物食呻。hnRNA蛋白在RNA加工的所有關(guān)鍵環(huán)節(jié)中都發(fā)揮重要作用流炕，包括前體mRNA剪接以及mRNA出核、定位仅胞、翻譯和穩(wěn)定性每辟。幾十種RNA結(jié)合蛋白(RBP)和基因的hnRNP蛋白與癌癥相關(guān)聯(lián)。

RNA-蛋白的相互作用可通過交聯(lián)免疫沉淀測序(CLIP-Seq)來測定饼问。在CLIP-Seq中影兽，細(xì)胞經(jīng)過紫外線處理，讓RBP與RNA復(fù)合物共價交聯(lián)莱革。細(xì)胞隨后被裂解峻堰，RBP-RNA復(fù)合物被免疫共沉淀，從而測序相應(yīng)的RNA盅视。

Wilbert M. L., Huelga S. C., Kapeli K., Stark T. J., Liang T. Y., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Mol Cell 48: 195-206
LIN28是個保守的RNA結(jié)合蛋白捐名，它與多能性、重編程和腫瘤的形成相關(guān)闹击。在各種不同的癌細(xì)胞和原發(fā)腫瘤組織中都發(fā)現(xiàn)LIN28的異常上調(diào)镶蹋。在這篇文章中，作者利用CLIP-Seq鑒定了大約四分之一分布于人類轉(zhuǎn)錄本中LIN28的結(jié)合位點赏半。從這些結(jié)合位點中他們發(fā)現(xiàn)贺归，LIN28與mRNA中富含環(huán)結(jié)構(gòu)的GGAGA序列結(jié)合。同時還發(fā)現(xiàn)了断箫，LIN28的表達(dá)能夠?qū)е驴勺兗羟兄械南掠巫兓?/p>

表觀遺傳和甲基化

癌癥發(fā)展過程中的表觀遺傳改變與異常的基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)拂酣。近期的研究證據(jù)表明，表觀遺傳上的改變可能在癌癥 起始中 發(fā)揮作用仲义。表觀遺傳的控制是通過多個不同過程進(jìn)行介導(dǎo)的婶熬，包括DNA修飾（甲基化或乙酰化）埃撵、組蛋白修飾和核小體重塑赵颅。發(fā)現(xiàn)控制表觀基因組的基因發(fā)生突變，在人類癌癥中是一個相當(dāng)普遍的現(xiàn)象暂刘。NGS測序技術(shù)提供了一整套工具饺谬，可定位突變并測定它們對癌癥發(fā)展的影響。

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癌癥中表觀遺傳修飾物的基因突變鸳惯。在不同類型的癌癥中經(jīng)常觀察到三類表觀遺傳修飾物發(fā)生突變商蕴，這突出了遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)之間的串?dāng)_叠萍。表觀遺傳修飾物的突變有可能引起癌癥的全基因組表觀遺傳改變芝发。了解遺傳和表觀遺傳變化的關(guān)系將為癌癥治療提供新的見解绪商。

DNA修飾

DNA修飾目前可以很容易地通過多種技術(shù)來進(jìn)行測定。不同技術(shù)的選擇取決于所需的通量和分辨率辅鲸。

table2

Bert S. A., Robinson M. D., Strbenac D., Statham A. L., Song J. Z., et al. Regional activation of the cancer genome by long-range epigenetic remodeling. Cancer Cell 23: 9-22
文章作者通過協(xié)同的長距離表觀遺傳激活（LREA）技術(shù)格郁，鑒定出一種結(jié)構(gòu)域基因去調(diào)控的機(jī)制。這些區(qū)域通常會跨越1Mb的基因組長度独悴，包括關(guān)鍵癌基因例书、microRNA和癌癥的生物標(biāo)志物基因。LREA結(jié)構(gòu)域中基因啟動子的特點是活性染色體標(biāo)記的的獲得和抑制標(biāo)記的丟失刻炒。

Brastianos P. K., Horowitz P. M., Santagata S., Jones R. T., McKenna A., et al. Genomic sequencing of meningiomas identifies oncogenic SMO and AKT1 mutations. Nat Genet 45: 285-289
為了鑒定和驗證腦膜瘤中的體細(xì)胞遺傳改變决采，作者對17個腦膜瘤進(jìn)行了全基因組或外顯子組測序，并對另外48個腫瘤進(jìn)行了靶向測序坟奥。他們所觀察到的突變譜是分布廣泛树瞭，但他們證實了43%的腫瘤中存在病灶NF2失活，并在另外8%的腫瘤中發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾物的改變爱谁。

Duncan C. G., Barwick B. G., Jin G., Rago C., Kapoor-Vazirani P., et al. A heterozygous IDH1R132H/WT mutation induces genome-wide alterations in DNA methylation. Genome Res 22: 2339-2355
腦膠質(zhì)瘤晒喷、急性骨髓性白血病和軟骨瘤中經(jīng)常發(fā)生NADP+依賴的異檸檬酸脫氫酶IDH1和IDH2的單等位點基因點突變。作者表明访敌，IDH1R132H等位基因的雜合表達(dá)足以誘導(dǎo)這些腫瘤特有的以DNA甲基化為特征的全基因組改變凉敲。這說明了IDH1R132H/WT突變體是推動人類癌細(xì)胞的表觀遺傳不穩(wěn)定性的原因。

Zhang J., Benavente C. A., McEvoy J., Flores-Otero J., Ding L., et al. A novel retinoblastoma therapy from genomic and epigenetic analyses. Nature 481: 329-334
視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是一種發(fā)生于視網(wǎng)膜的侵襲性兒童癌癥寺旺，由RB1失活所引發(fā)爷抓，但潛在機(jī)理仍然未知。在此類高度侵襲性的癌癥中阻塑，許多基因都參與其中蓝撇，但RB1是唯一的已知發(fā)生突變的癌基因。與有限的體細(xì)胞突變不同叮姑，相對正常的成視網(wǎng)膜細(xì)胞唉地，腫瘤的甲基化圖譜表現(xiàn)出巨大的改變。最驚人的結(jié)果之一是人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中原癌基因脾絡(luò)氨酸激酶（SYK）的誘導(dǎo)表達(dá)传透。SYK是腫瘤細(xì)胞生存所必需的耘沼。研究人員接著表明，小分子抑制劑對SYK的抑制導(dǎo)致培養(yǎng)和體內(nèi)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的細(xì)胞死亡朱盐。

實驗設(shè)計上的注意事項

每種組織和細(xì)胞類型都有著獨特的甲基化模式群嗤；因此必須獲得感興趣的組織以便分析。癌癥研究中兵琳，腫瘤組織-癌旁正常組織的配對可簡化分析狂秘。

通過重亞硝酸氫鹽測序所產(chǎn)生的超大量CpG標(biāo)志物很難解釋骇径，且可靠的統(tǒng)計學(xué)分析目前仍然困難重重。不過者春，下面一些實際的方法可簡化分析：

• RRBS-Seq通過限制覆蓋度而簡化分析破衔；
• 綜合分析大大改善了結(jié)果的可解釋性。例如钱烟，將表達(dá)分析與甲基化分析相結(jié)合晰筛，讓我們可專注于表達(dá)水平改變的基因；
• 將分析限制在某個感興趣的基因或區(qū)域中拴袭。這種方法對GWAS的后續(xù)研究很有效读第，也適合已有實驗證據(jù)說明目的區(qū)域存在基因調(diào)控或染色質(zhì)重塑的研究。與降低代表性的方法不同拥刻。這種方法實現(xiàn)了更多區(qū)域的分析怜瞒，因此可獲得更多信息。

組織培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎使用般哼。隨著時間的推移和組織增殖吴汪，培養(yǎng)物的甲基化水平可能已經(jīng)改變，不大能代表原先的組織樣本逝她。

組蛋白修飾

組蛋白修飾通常指的是甲基化和乙踅阶化。組蛋白H3K9黔宛、H3K27和H4K20的甲基化與基因轉(zhuǎn)錄的抑制相關(guān)近刘，而H3K4和H3K36的三甲基化與活性轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)相關(guān)。組蛋白乙跬位危化幾乎總是與染色質(zhì)可接近性和轉(zhuǎn)錄活性水平的增高相關(guān)觉渴。通過操控染色質(zhì)狀態(tài)和DNA可接近性，表觀遺傳修飾在各個發(fā)育階段徽惋、組織類型和疾病中都對基因表達(dá)的控制起著關(guān)鍵作用案淋。

Wilkinson A. C., Ballabio E., Geng H., North P., Tapia M., et al. (2013) RUNX1 is a key target in t(4;11) leukemias that contributes to gene activation through an AF4-MLL complex interaction. Cell Rep 3: 116-127
這篇文章報道了一種轉(zhuǎn)化機(jī)制，其中兩個致癌融合蛋白合作激活目的基因险绘，然后調(diào)節(jié)其下游產(chǎn)物的功能踢京。

實驗設(shè)計上的注意事項

每種組織和細(xì)胞類型都有著獨特的甲基化模式；因此必須獲得目的組織以便分析宦棺。

組蛋白修飾可以通過各種ChIP-Seq方法進(jìn)行檢測瓣距，原理是通過抗體與目標(biāo)甲基化組蛋白進(jìn)行特異結(jié)合。

同樣代咸，組織培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎使用蹈丸。隨著時間的推移和組織增殖，培養(yǎng)物的甲基化水平可能已經(jīng)改變，不大能代表原先的組織樣本逻杖。

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與重排

染色體重排需要DNA雙鏈斷裂的形成和連接奋岁。這些事件的發(fā)生，會破壞基因組的完整性荸百，并經(jīng)常在白血病闻伶、淋巴瘤和肉瘤中觀察到。并且特定基因間的反復(fù)的基因融合在不同的個體中均觀察到管搪，這表明這些基因一定在細(xì)胞周期中的某個階段他們之間的物理位置非常接近虾攻。

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這是一個設(shè)想的三維铡买、具有轉(zhuǎn)錄活性的復(fù)合物更鲁，它包含了致密的環(huán)化位置。這個示意圖是基于檢測到的成環(huán)事件奇钞，并假設(shè)所有成環(huán)事件都能發(fā)生在單個細(xì)胞內(nèi)澡为。在這個模型中，所有小環(huán)匯集到一個共同的核心（藍(lán)色球）景埃。環(huán)降低了轉(zhuǎn)錄活性復(fù)合物的物理大小媒至，從而推動轉(zhuǎn)錄因子接近待定的基因組位點。

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檢測染色質(zhì)相互作用谷徙。在三維空間中拒啰，相同或不同染色體上遠(yuǎn)端的基因組區(qū)域相互作用，而這種相互作用是由一個或多個DNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的完慧。a) ChIP-Seq 利用染色質(zhì)免疫共沉淀來鑒定DNA和蛋白的相互作用谋旦。人們采用各種DNA-片段化方法和核酸外切酶，來縮小片段的大小分布屈尼。b)染色質(zhì)構(gòu)像捕獲實驗利用一個連接步驟將互作的染色質(zhì)片段相連接册着。這種方法可鑒定與遙遠(yuǎn)序列相結(jié)合的蛋白。c)配對末端標(biāo)簽測序分析染色質(zhì)相互作用（ChIA-PET）同樣也利用連接步驟來檢測染色質(zhì)相互作用脾歧，將不相鄰的互作區(qū)域配對甲捏。然而鸽扁，ChIA-PET利用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）步驟钾唬，只能鑒定特定蛋白的相互作用，如RNA聚合酶II盈蛮。

參考文獻(xiàn)

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作者利用測序以及染色體構(gòu)像捕獲（3C）和ChIA-PET表明兄纺，TNF_alpha誘導(dǎo)響應(yīng)基因聚集在分散的『NF-B工廠』大溜。一些『工廠』還專門轉(zhuǎn)錄編碼miRNA的響應(yīng)基因，這些miRNA靶定下調(diào)的mRNA囤热。

Rocha P. P., Micsinai M., Kim J. R., Hewitt S. L., Souza P. P., et al. Close proximity to Igh is a contributing factor to AID-mediated translocations. Mol Cell 47: 873-885
細(xì)胞核組織可決定『脫靶』活性以及融合伴侶的選擇猎提。這項研究表明，絕大多數(shù)已知的活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶（AID）介導(dǎo)的Igh轉(zhuǎn)位伴侶在類型轉(zhuǎn)換過程中與此位點接觸的染色體結(jié)構(gòu)中被發(fā)現(xiàn)。此外锨苏，這些相互作用結(jié)構(gòu)域可用來鑒定被AID靶定的其他基因疙教。

Theodoratou E., Montazeri Z., Hawken S., Allum G. C., Gong J., et al. Systematic meta- analyses and field synopsis of genetic association studies in colorectal cancer. J Natl Cancer Inst 104: 1433-1457
這篇研究文章表明，T細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子GATA3在介導(dǎo)增強(qiáng)子接近調(diào)控區(qū)域上扮演了重要角色伞租，這些調(diào)控區(qū)域參與了雌激素受體（ESR1）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄贞谓。GATA3沉默導(dǎo)致在雌激素刺激之前輔助因子和活性組蛋白標(biāo)記的整體重新分配。

Hakim O., Resch W., Yamane A., Klein I., Kieffer-Kwon K. R., et al. (2012) DNA damage defines sites of recurrent chromosomal translocations in B lymphocytes. Nature 484: 69-74
作者發(fā)現(xiàn)葵诈，在培養(yǎng)的小鼠B淋巴細(xì)胞中裸弦，缺乏經(jīng)常性的DNA損傷時，Igh或Myc與其他所有基因之間的易位與它們的接觸頻率直接相關(guān)作喘。反過來理疙，與經(jīng)常性位點指向的DNA損傷相關(guān)的易位與DNA斷裂形成的速率成正比。他們認(rèn)為泞坦，非定向重排反映了細(xì)胞核結(jié)構(gòu)窖贤，而DNA斷裂形成決定了包括驅(qū)動B細(xì)胞惡性腫瘤在內(nèi)的經(jīng)常性易位的位置和頻率。

綜合分析（多組學(xué)分析）

所有的生物過程都是相互關(guān)聯(lián)的贰锁，而在癌細(xì)胞發(fā)生過程的任何一個變化都會影響其他所有過程赃梧。突變可能影響所表達(dá)的活性，繼而又影響DNA甲基化豌熄，再就影響其他許多基因的表達(dá)等等一連串的反應(yīng)授嘀。每個個體都有著大量的特有突變，再加上這一連串的事件锣险，能夠讓人們深入研究各種用于區(qū)分癌癥的疾病表型蹄皱。綜合分析可以使揭示癌癥生物學(xué)的真正復(fù)雜性向前邁進(jìn)了一步。研究人員如今能夠檢測大部分的單個過程囱持，但認(rèn)識和治療癌癥的真正進(jìn)步將來自于對所有這些過程的綜合分析夯接，也就是常說的多組學(xué)分析。

參考文獻(xiàn)

Weischenfeldt J., Simon R., Feuerbach L., Schlangen K., Weichenhan D., et al. (2013) Integrative genomic analyses reveal an androgen-driven somatic alteration landscape in early-onset prostate cancer. Cancer Cell 23: 159-170
作者發(fā)現(xiàn)纷妆，早發(fā)性前列腺癌的形成涉及到雄激素驅(qū)動的結(jié)構(gòu)重排盔几。相比之下，老年發(fā)病的前列腺癌積累了非雄激素相關(guān)的結(jié)構(gòu)重排掩幢，表明一種不同的腫瘤形成機(jī)制逊拍。

Cowper-Sal lari R., Zhang X., Wright J. B., Bailey S. D., Cole M. D., et al. (2012) Breast cancer risk- associated SNPs modulate the affinity of chromatin for FOXA1 and alter gene expression. Nat Genet 44: 1191-1198
作者表明，與乳腺癌風(fēng)險相關(guān)的SNP集中在FOXA1和ESR1的順反組（cistrome）际邻，以及組蛋白H3賴氨酸4單甲基化（H3K4me1）的表觀基因組芯丧。大多數(shù)的風(fēng)險相關(guān)SNP調(diào)控FOXA1在遠(yuǎn)端調(diào)控元件的染色質(zhì)親和力，這導(dǎo)致等位基因特異的基因表達(dá)世曾。

Peifer M., Fernandez-Cuesta L., Sos M. L., George J., Seidel D., et al. (2012) Integrative genome analyses identify key somatic driver mutations of small-cell lung cancer. Nat Genet 44: 1104-1110
作者發(fā)現(xiàn)了TP53和RB1失活的證據(jù)缨恒，并在編碼組蛋白修飾物的基因中發(fā)現(xiàn)了反復(fù)的突變。此外，他們還在PTEN骗露、SLIT2和EPHA7中觀察到突變岭佳，以及FGFR1絡(luò)氨酸激酶基因的病灶擴(kuò)增。這種綜合分析表明萧锉，組蛋白修飾可能與小細(xì)胞肺癌（SCLC）有關(guān)珊随。

技術(shù)參考

一個良好的實驗設(shè)計可以提高技術(shù)性能，從而產(chǎn)生最易解釋和可靠的結(jié)果柿隙。這里重點強(qiáng)調(diào)研究人員在設(shè)計實驗時必須牢記的生物學(xué)和技術(shù)的特性叶洞。

癌癥中的實驗設(shè)計面臨一些獨特的挑戰(zhàn)。典型的腫瘤樣本包含兩個基因組：遺傳自父母的生殖細(xì)胞系（germline）和在疾病發(fā)展過程中積累的體細(xì)胞突變（somatic mutations）禀崖。腫瘤細(xì)胞在樣本中的比例可能在10%-100%之間衩辟。腫瘤基因組也是動態(tài)的，會快速積累 de novo 突變帆焕。因此惭婿，每一個腫瘤中又可能同時包含幾個克隆亞型。

目前大部分已發(fā)表研究的樣本量都非常小叶雹，可被視為僅是提出了相關(guān)的假說。而隨著越來越多的測序信息被我們所獲得换吧，大部分癌癥類型可根據(jù)其分子表型折晦，被分成多個亞群。這嚴(yán)重降低了實驗的能力沾瓦，并增加了嚴(yán)格分析所需的樣本數(shù)量满着。部分解決這一難題的方案是在探索階段利用全基因組測序來尋找新的突變。在第二階段贯莺，利用全外顯子組或靶向測序來確認(rèn)新發(fā)現(xiàn)的這些突變风喇，并確定他們在大型隊列中的豐度。然而缕探，在未來魂莫，統(tǒng)計學(xué)上嚴(yán)謹(jǐn)?shù)娜蚪M測序?qū)嶒炗锌赡苁欠浅４蟮模枰獢?shù)千個樣本爹耗。

使用NGS測序技術(shù)進(jìn)行深度測序是指多次生成定位到同一區(qū)域的序列片段耙考，有時達(dá)上百次。但由于每條序列片段是從單個DNA分子中產(chǎn)生的潭兽，故提高深度測序能夠?qū)崿F(xiàn)原始樣品中低至1%的克隆的檢測倦始。比較同一個體的腫瘤和癌旁正常組織的序列，我們可以很容易識別浸潤組織的序列片段山卦。最佳的讀取深度將取決于癌癥類型和所需的靈敏度鞋邑，但一般建議為正常基因組最低為40倍的覆蓋深度，而癌癥基因組需要80倍以上的覆蓋深度枚碗。在腫瘤高度異質(zhì)時藻懒，可能需要腫瘤不同部位的多次活檢，才能包含所有的細(xì)胞類型视译。

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在這個假定的例子中嬉荆，腫瘤含有兩個癌癥克隆和鄰近組織。腫瘤樣本中正常細(xì)胞所產(chǎn)生的序列（圖中：比對中的前兩個序列）可通過與鄰近正常組織所產(chǎn)生的序列比較后確定酷含。腫瘤樣本中的剩余序列可分為兩組鄙早，分別代表主要和次要的腫瘤克隆。次要克隆椅亚，若不及時治療限番，可能在復(fù)發(fā)時成為腫瘤的主要組分。在實際分析中呀舔，腫瘤樣本至少要有40倍的覆蓋深度弥虐，并覆蓋靶定的基因集合、全外顯子組或全基因組媚赖。

檢測癌癥基因組中的體細(xì)胞突變通常有三種方法：全基因組測序霜瘪、全外顯子組測序和靶向基因測序。下表簡要介紹了每種方法的有點和缺點惧磺。在比較多發(fā)性骨髓瘤的全基因組和外顯子組測序時颖对，半數(shù)的蛋白編碼突變通過染色體畸變（如易位）而存在，其中大部分不能單獨被外顯子組測序而發(fā)現(xiàn)磨隘。靶向重測序是一種有用的技術(shù)缤底，可收錄超大隊列中已知癌癥相關(guān)基因的突變。從長遠(yuǎn)來看番捂，隨著我們對基因組的了解日益加深个唧，并且我們處理和解釋大型數(shù)據(jù)集的能力的提高，全基因組測序無疑是最好的腫瘤分子鑒定方法设预。而在短期內(nèi)徙歼，靶向基因測序可為患者匹配出市場上已有的藥物，讓他們立刻受益絮缅。

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參考來源

Illumina cancer research