本文發(fā)表在nature cell biology骄恶，https:/ / doi.org/10.1038/ s41556-019-0299-0，喜歡的老師可以下載閱讀。
代謝重編程在腫瘤特別是惡性腫瘤中非常常見银还，作者發(fā)現(xiàn)了這個HISLA可以起到增強乳腺癌細胞的有氧糖酵解和抗凋亡能力，從機制上講洁墙，HISLA可以阻斷PHD2與HIF1α的相互作用，從而抑制HIF1α的羥基化和降解戒财。反過來热监，糖酵解腫瘤細胞釋放的乳酸上調(diào)巨噬細胞中的HISLA，構(gòu)成TAMS和腫瘤細胞之間的前饋環(huán)路饮寞。阻斷EV傳播的HISLA可抑制體內(nèi)乳腺癌的糖酵解和化療耐藥孝扛。在臨床樣本中，TAM中HISLA的表達與糖酵解幽崩、化療反應(yīng)差和乳腺癌患者的生存期縮短有關(guān)苦始。（文章還是從基礎(chǔ)研究下手，結(jié)合臨床發(fā)現(xiàn)有臨床意義慌申，高分必備套路澳把 ）別廢話，上圖蹄溉。
敲黑板了咨油，話說糖代謝有哪些途徑？我能記得的只有有氧氧化柒爵、無氧糖酵解役电、磷酸戊糖途徑，還有別的嗎棉胀？多了去了法瑟，有氧糖酵解了解一下Warburg效應(yīng)，有氧狀態(tài)下唁奢，腫瘤細胞對糖攝取很活躍霎挟，但是利用率低下，通過糖酵解形成乳酸驮瞧。本文講了TAM和乳腺癌有氧糖酵解的關(guān)系氓扛，那么作者上來就直接做表型，發(fā)現(xiàn)TAM可促進乳腺癌細胞的有氧糖酵解，抑制細胞凋亡采郎。這里的TAM作者用了CD68標(biāo)記千所，別動，這不是M2型巨噬細胞的表面標(biāo)記物嗎蒜埋？那么研究糖酵解是不是應(yīng)該了解糖酵解途徑相關(guān)的蛋白淫痰，看看變化情況，這里作者研究了葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3(GLUT3)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1)整份，以及己糖激酶2(HK2)待错。這個糖酵解是無氧狀態(tài)發(fā)生的，腫瘤因其生長活躍 烈评，中心部位多數(shù)為缺氧區(qū)域火俄，所以，通過免疫組化發(fā)現(xiàn)在中心區(qū)域的腫瘤邊緣糖酵解活躍讲冠，而且TAM豐富瓜客，且TAM與糖酵解定量分析呈正相關(guān)。
然后作者又去Oncomine挖數(shù)據(jù)了否彩，發(fā)現(xiàn)CD68+TAM浸潤與GLUT3疯攒、GLUT1和LDHA(乳酸脫氫酶)表達的相關(guān)性，與作者上實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致列荔。作者發(fā)現(xiàn)在那些新輔助化療的患者中敬尺，與低GLUT3水平和TAM浸潤的腫瘤組織相比，高GLUT3水平和TAMS浸潤的腫瘤組織中的癌細胞凋亡明顯減少贴浙。這里出現(xiàn)了兩個問題筷转，一個是TAM與糖酵解，一個是TAM與腫瘤凋亡悬而。下面就是愉快的驗證環(huán)節(jié)呜舒。作者從人乳腺癌組織中提出CD68+TAM或者用乳腺癌條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人血的巨噬細胞促進形成CD68+TAM,然后作者用Transwell實驗培養(yǎng)了提取的TAM和人乳腺癌細胞系，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后乳腺癌細胞外酸化率升高笨奠，乳酸生成袭蝗，葡萄糖消耗（這里與未共同培養(yǎng)以及和人巨噬細胞MDMs培養(yǎng)做的對比）。此外般婆，與TAM共培養(yǎng)的腫瘤細胞有較高的糖酵解酶表達到腥，包括GLUT3、HK2蔚袍、PKM2(丙酮酸激酶同工酶M2)和LDHA乡范。
然后作者又來驗證乳腺癌細胞系凋亡是否改變的了配名，這里做的是FACS（做凋亡、細胞周期好像用這個已經(jīng)是常規(guī)了吧）晋辆，作者又作了 anoikis assays（也是一種凋亡實驗）（作者這是說明了什么呢渠脉？腫瘤在TAM存在的情況下即使是脫離了周圍的基質(zhì)也能存活下來，這種凋亡與BCL-2有關(guān)瓶佳，作者不驗證一下嗎）芋膘。
下面繼續(xù)說糖酵解，無氧狀態(tài)下糖的利用需要一種重要的蛋白HIF-1α（沒錯霸饲，就是去年剛得諾貝爾的那個研究为朋，我感覺作者有蹭熱點的嫌疑），在有氧的狀態(tài)下它就被降解掉了厚脉∠按纾看看和TAM培養(yǎng)的腫瘤內(nèi)部HIF-1α表達情況如何，果然很多傻工，但是融涣，mRNA的水平并沒有很多變化，說明了什么肯定有什么玩意兒促進了蛋白的穩(wěn)定精钮。敲減了HIF-1α后，ECAR剃斧、糖消耗轨香、乳酸生成也相應(yīng)變化了。與糖酵解相關(guān)的蛋白也發(fā)生了變化.
然后哦幼东，作者又作了凋亡臂容，敲減HIF-1α后凋亡也增多了，說明了HIF-1α在糖酵解和凋亡中起到關(guān)鍵作用了根蟹。
介紹了這么多脓杉，那么TAM靠的什么本事讓腫瘤細胞度過重重困難活下來的呢？通過transwell實驗知道肯定不是細胞直接接觸简逮，這里又要說外泌體了（如何排除一些分泌蛋白球散、脂質(zhì)對腫瘤的作用呢？目前還是個難題散庶，這種情況只能是外泌體和去外泌體上清分別培養(yǎng)看看情況）蕉堰。作者居然還用了標(biāo)記觀察腫瘤攝取外泌體的過程。然后分別用外泌體悲龟、上清屋讶、上清+外泌體抗體CD81處理腫瘤，對代謝相關(guān)的ECAR须教、糖消耗皿渗、乳酸形成又驗證了一波。結(jié)果你懂的。剛才不是說凋亡來著嗎乐疆？作者也作了划乖，只是在補充圖里了，其實結(jié)果是一致的诀拭，就不給上圖了迁筛。
知道外泌體作用了后筒占，下一步直接找外泌體成分贪庙。TAM與MDM外泌體對比找差異來一波。這里用到芯片技術(shù)翰苫，與未經(jīng)治療的MDM相比止邮，pol-TAMs的EVS中88個lncRNAs的表達上調(diào)了5倍以上。在這88個lncRNA中奏窑，pol-TAMs組有10個比MDM組上調(diào)3倍以上导披，而與pol-TAMs共培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞中有7個與未共培養(yǎng)組相比上調(diào)2倍以上。此外埃唯，定量PCR結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄(qRT-PCR)證實撩匕，在pol-TAMs誘導(dǎo)的EVS中，7個LncRNAs中有5個增加了5倍以上墨叛，在與pol-TAMs共同培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞中止毕，有5個增加了3倍以上，抑制TAM外泌體分泌發(fā)現(xiàn)腫瘤中升高的Lnc也相應(yīng)下降了漠趁。說明了腫瘤里L(fēng)nc升高時TAM外泌體引起的扁凛。
作者在補充實驗里在TAM中沉默了上述5個lnc，發(fā)現(xiàn)了對腫瘤糖酵解相關(guān)的lnc-HISLA闯传，只有沉默了HISLA谨朝，才會導(dǎo)致腫瘤糖利用障礙∩蹋可以達到與抑制外泌體分泌相同的效果叠必。還記得前兩天分享的文章中說的方法嗎，直接在靶細胞中沉默它妹窖，觀察效果纬朝，顯然，結(jié)果與預(yù)期一致骄呼。
下面該說這個HISLA了共苛，這個對照怎么找判没，一般非編碼lnc的對照就是它的反義鏈（也就時編碼lnc對應(yīng)的那條DNA單鏈），剩下的就是做HISLA功能試驗了（靶點隅茎，gain and loss of function等）澄峰。在腫瘤細胞中的異位表達HISLA顯著促進了有氧糖酵解，用α-Amanitin(RNA聚合酶II和III的特異性抑制劑)處理MDA-MB-231細胞以抑制內(nèi)源性RNA轉(zhuǎn)錄辟犀，并不影響在TAM外泌體處理下HISLA的升高俏竞。說明兩個問題：1.這個HISLA是外來的 2.這個HISLA不能自己合成（這個好像說的是一個意思啊）堂竟。而且在TAM中沉默了HISLA增加腫瘤細胞的凋亡魂毁，同時也抑制了遷移和侵襲。然后作者又驗證了一波這個HISLA+外泌體進入腫瘤細胞的過程（這不是畫蛇添足了嗎出嘹，上面都驗證過了席楚，你也換著圖看看，比如外泌體和HISLA共位啥的）
對了税稼，做LncRNA還要做明確幾個問題：1.這個LncRNA在是存在的 2.長度要大于200nt烦秩，但是也別太長，超過3000nt都不好構(gòu)建郎仆， 3.這個玩意兒不能編碼蛋白質(zhì) 4.這個lncRNA它是有意義的只祠，如果不能互補結(jié)合或者與蛋白結(jié)合,它存在是沒有意義的。作者發(fā)現(xiàn)HISLA在TAM外泌體中比MDM的多扰肌，而且TAM外泌體處理后的腫瘤比未處理的要多抛寝。
作者下一步又為了嚴(yán)謹期間驗證了腫瘤微環(huán)境TME中各種細胞HISLA的表達情況，發(fā)現(xiàn)了我們發(fā)現(xiàn)HISLA的表達選擇性地表達在巨噬細胞和B淋巴細胞中（作者補充材料里狡耻，我這里不加了，不影響閱讀）猴凹。這表明它的轉(zhuǎn)錄是由譜系特異的因子負責(zé)的夷狰。為此，JASPAR的序列分析揭示了HISLA啟動子上轉(zhuǎn)錄因子PU.1的典型結(jié)合motif(這個motif是什么大家可以去看看一篇網(wǎng)友的文章)郊霎，PU.1是髓系和B淋巴細胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子沼头。在CHIP試驗中發(fā)現(xiàn)PU.1與HILSLA啟動子區(qū)域結(jié)合，作者進一步為了驗證這個轉(zhuǎn)錄因子與HISLA的關(guān)系书劝，當(dāng)然還是構(gòu)建熒光素酶報告基因进倍，用了一個內(nèi)源性表達PU.1的THP-1細胞，把HISLA5’端序列插入到熒光素酶基因前方购对，發(fā)現(xiàn)熒光素酶表達增多（與motif突變序列相比）猾昆，在TAM細胞水平沉默了PU.1后發(fā)現(xiàn)HISLA表達也降低。至此骡苞，說明了PU.1與HISLA的關(guān)系垂蜗。
從前面的測序結(jié)果知道TAM比MDM HISLA的表達要多楷扬，說明TAM表型變化促進了HISLA的表達，那結(jié)合以往的經(jīng)驗贴见，說明TAM表型改變相關(guān)的物質(zhì)包括GM-CSF和乳酸烘苹，驗證后表明是乳酸刺激了HISLA的表達。作者又在附加資料中驗證了多少濃度的乳酸可以誘導(dǎo)TAM表達HISLA增加（5mM）片部。
更奇怪的是镣衡，高表達HISLA的TAM，HIF-1a也高表達档悠，也進行著糖酵解廊鸥。抑制腫瘤乳酸釋放也減輕了TAM的糖酵解過程。
這個乳酸提高了HISLA的表達站粟，和PU.1什么關(guān)系黍图，然而作者附加實驗驗證了，并沒有奴烙，但是結(jié)合HISLA升高的事實助被，那么找到這個C是什么，再次看看HISLA的motif結(jié)合因子切诀，發(fā)現(xiàn)了ERK下游的ELK1揩环，既往也報道過乳酸刺激ERK信號通路的研究，TAM中ERK高表達幅虑，沉默ELK1或者加入ERK抑制劑果然減少了HISLA的表達丰滑，說明了HISLA的表達是通過不同的途徑進行的，作者得出結(jié)論：髓系特異性PU1介導(dǎo)HISLA的基礎(chǔ)表達倒庵，而乳酸通過ERK-ELK1信號進一步上調(diào)HISLA褒墨。（掌聲在哪里？擎宝？）
說了這么多郁妈，HISLA是怎么和HIF-1a起作用的呢（無非就是促進MRNA表達，穩(wěn)定mRAN或者抑制HIF-1a降解绍申，說著簡單噩咪，其實很復(fù)雜，要驗證很多東西的）极阅？前面說了腫瘤內(nèi)HIF-1a的蛋白和mRNA無相關(guān)性胃碾，說明蛋白半衰期延長，通過免疫共沉淀和免疫印跡結(jié)果顯示TAM 外泌體處理或與TAM共培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞中筋搏，缺氧誘導(dǎo)因子-1α的羥基化和降解明顯減少仆百。表明這些細胞中的PHD2和VHL的功能受到抑制。然而奔脐，PHD2和VHL的表達在用或不用TAM 外泌體處理的MDA-MB-231細胞中是相似的儒旬。重要的是栏账，減少外泌體或者腫瘤細胞的HISLA均增強了HIF-1α的羥基化和降解，過表達結(jié)果正相反栈源。
是不是需要做一下RIP拉一下看看結(jié)果了挡爵。然后在共位一下看看啊Ｉ蹩选茶鹃！安排。
利用體外系統(tǒng)和重組蛋白迄埃，將HISLA加入而不是HISLA-AS發(fā)現(xiàn)HIF-1a與PHD2的結(jié)合減少疗韵，作者在體外把標(biāo)記的HISLA與PHD2或HIF-1a進行孵育，作了RIP侄非，發(fā)現(xiàn)拉下了PHD2蕉汪。以上驗證了HISLA的作用靶點，Lnc的核苷酸鏈很長逞怨，究竟是哪一段參與到結(jié)合作用中去呢者疤，這就需要分段構(gòu)建后再進行RIP（這工作量，沃特福WTF）,發(fā)現(xiàn)HISLA(HISLA190-248)的190-248核苷酸形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)是唯一與PHD2相互作用的基序此外叠赦，破壞HISLA190-248莖環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸突變?nèi)∠薍ISLA和PHD2之間的相互作用驹马。將HISLA190-248加入到體外系統(tǒng)也抑制了HIF-1a與PHD2的結(jié)合，異位過表達HISLA190-248也顯著抑制了HIF-1a的羥基化降解
機制部分說到這個是不是已經(jīng)很明了了除秀，下面總結(jié)一小下：腫瘤相關(guān)的TAM選擇性聚集在腫瘤中心邊緣缺氧區(qū)域糯累，TAM自身表達HISLA通過外泌體釋放被腫瘤攝取，腫瘤利用HISLA抑制了PHD2的功能册踩，促進了HIF-1a的集聚泳姐，使腫瘤可以在缺氧環(huán)境下繼續(xù)利用葡萄糖代謝產(chǎn)生能量，同時副產(chǎn)物乳酸又能夠協(xié)同刺激TAM棍好，通過ERK-ELF1軸刺激HISLA的轉(zhuǎn)錄仗岸，增強了TAM 外泌體對腫瘤代謝物重編程的過程允耿。體外和機制講完了借笙，是不是還缺了體內(nèi)和臨床。來來來较锡，繼續(xù)整起业稼。作者也是聯(lián)合腫瘤和TAM或TAM的外泌體注射到裸鼠乳脂墊中進行成瘤分析。發(fā)現(xiàn)聯(lián)合TAM或者TAM外泌體的那批裸鼠腫瘤更大蚂蕴，對化療耐藥低散。
他們還給裸鼠作了PET-CT，有錢引镊，有錢朦蕴，WTF。讓我已瞎的眼又瞎了一遍弟头。
他們還發(fā)現(xiàn)HISLA及TAM外泌體在肺轉(zhuǎn)移中還有作用吩抓。我的眼。你能信赴恨，不加TAM中立都不轉(zhuǎn)移疹娶，加了就轉(zhuǎn)移。
體內(nèi)結(jié)束了伦连，該臨床了愿吹，無非就是檢測血中HISLA與臨床相關(guān)性的問題。首先HISLA與CD68+TAM增多相關(guān)剑逃，而且文章開始說的那些蛋白相關(guān)扁远，其次，腫瘤HIF-1a與HISLA相關(guān) 汛聚，最后锹安，血中的HISLA與對應(yīng)腫瘤中分離的TAM中的HISLA相關(guān)。在組織病理水平倚舀，HISLA高表達與組織學(xué)分級叹哭、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HER2亞型有關(guān)痕貌。此外风罩，高水平的HISLA表達和GLUT3表達與患者較差的無病生存率相關(guān)，進展期或穩(wěn)定期乳腺癌患者在新輔助化療前獲得的腫瘤活檢組織中HISLA的表達比部分或完全緩解者高得多舵稠。我就不解釋了超升，直接上圖吧，臨床相關(guān)這部分都是文章最簡單的地方了哺徊。
至此室琢，本文結(jié)束了，這篇文章以前讀過落追，但是盈滴，那時剛接觸科研，對其中一些道理也不是很清楚轿钠，只是知道個框架巢钓，現(xiàn)在回頭看看病苗，還是有很多收獲，文章結(jié)構(gòu)嚴(yán)謹症汹，基本上還是圍繞了HISLA進行展開硫朦，結(jié)合細胞、組織背镇、體內(nèi)阵幸、體外、臨床進行相關(guān)分析研究芽世，并沒有局限在由A到B的論證途徑挚赊，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的C，也說明了生物體調(diào)控是復(fù)雜的济瓢，并不是單一的荠割，每一個生物過程都應(yīng)該是多系統(tǒng)、多基因參與的旺矾，這樣才能達到調(diào)控的精準(zhǔn)蔑鹦，同時文章的臨床應(yīng)用價值我自認為還是比較大的，腫瘤生長需要血管箕宙，需要一個適宜的微環(huán)境嚎朽，當(dāng)環(huán)境改變的時候可以讓腫瘤代謝重編程，這在所有實體腫瘤中幾乎是普遍存在的現(xiàn)象柬帕，如果能夠在這個過程中找到相應(yīng)治療的靶點哟忍，將會對腫瘤治療產(chǎn)生翻天覆地的變化。文章應(yīng)用了包括芯片技術(shù)陷寝、RIP锅很、CHIP、pull-down凤跑、FACS等高大上的技術(shù)加持爆安，上分還是很容易的，可能作者也蹭了當(dāng)下的熱點：外泌體仔引，非編碼RNA扔仓、HIF-1a（諾獎），如果入門非編碼領(lǐng)域研究的話算得上是一篇非常不錯的范文咖耘。謝謝大家翘簇！如有錯誤，望批評鲤看、指正缘揪。
