相較于單細(xì)胞測(cè)序本身而言，畢業(yè)顯然是各位更關(guān)注的問(wèn)題蛙紫，"單細(xì)胞測(cè)序做到啥程度能畢業(yè)"這個(gè)問(wèn)題總是在我的腦海中揮之不去，此前我們已經(jīng)整理了碩士篇的內(nèi)容：單細(xì)胞測(cè)序做到什么程度能畢業(yè)|碩士篇。上次的推送大家互動(dòng)地比較熱烈诞外，所以今天也應(yīng)大家要求推出博士篇鲸伴。首先府蔗，Biomamba目前博二，沒(méi)博士畢業(yè)過(guò)汞窗，所以我說(shuō)的也還是不算姓赤，回答這個(gè)問(wèn)題的最好方法，就是去知網(wǎng)翻一番各位博士的畢業(yè)論文仲吏。另外不铆，由于我精力有限蝌焚，只翻了幾篇文章，具有一定的偶然性誓斥，并且雖然我們的主題是單細(xì)胞測(cè)序只洒，但事實(shí)上我們談?wù)摰闹饕菃渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(我此前所做的教程也是，其實(shí)還有很多的單細(xì)胞組學(xué)我們沒(méi)有時(shí)間去介紹)劳坑，大家有更多的想法也歡迎在后臺(tái)或交流群(永久免費(fèi)的千人生信毕谴、科研交流群)中一起交流。如果想系統(tǒng)性的學(xué)習(xí)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析也可以看這里：單細(xì)胞數(shù)據(jù)基礎(chǔ)分析學(xué)習(xí)手冊(cè)距芬。
首先涝开，我以“單細(xì)胞測(cè)序”為關(guān)鍵詞在“博士學(xué)位論文”的范圍內(nèi)進(jìn)行檢索，由于畢業(yè)論文沒(méi)有影響因子一說(shuō)框仔，我們挑了幾篇博士論文中下載次數(shù)較高和時(shí)間較近的舀武。

第一篇

這篇是來(lái)海軍軍醫(yī)大學(xué)的名為“基于單細(xì)胞測(cè)序探究強(qiáng)直性脊柱炎炎癥和骨化進(jìn)程中巨噬細(xì)胞和干細(xì)胞的交互關(guān)系”的文章[1]，于2021年5月答辯离斩，下載次數(shù)1489次[1]银舱。該畢業(yè)論文全長(zhǎng)113頁(yè)，掐頭去尾(去除目錄捐腿、聲明纵朋、致謝等內(nèi)容)107頁(yè)內(nèi)容。這位博士的專業(yè)為外科學(xué)茄袖，應(yīng)當(dāng)是一位臨床醫(yī)師操软，看學(xué)號(hào)和致謝內(nèi)容應(yīng)當(dāng)是16年入學(xué)18年轉(zhuǎn)博、21年畢業(yè)宪祥，在學(xué)期間以第一作者或共同第一作者共發(fā)表了5篇SCI聂薪、兩篇中文論文，參與了兩個(gè)基因項(xiàng)目蝗羊，以第一發(fā)明人的身份注冊(cè)了五項(xiàng)專利藏澳。若其在五年時(shí)光的坐診之余還獨(dú)立完成了這些科研工作，我向其獻(xiàn)上最真摯的敬意耀找。

來(lái)了解一下具體內(nèi)容翔悠，強(qiáng)制性脊柱炎(AS)的背景內(nèi)容這里就不描述了，這里我依然只展示我關(guān)注的內(nèi)容野芒，感興趣的同學(xué)可以讀一下原文蓄愁。首先作者收集了5例脊柱矯形的AS病人和三例脊柱骨折的健康對(duì)照者相同腰椎節(jié)段棘上韌帶、棘間韌帶和黃韌帶附著點(diǎn)組織(好吧狞悲，臨床樣本撮抓，是我羨慕的)，通過(guò)DB Rhapsody技術(shù)完成單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序摇锋。

接下來(lái)就是比較常規(guī)的分群丹拯、找marker站超、注釋、利用Marker的富集分析鑒定各細(xì)胞功能乖酬，鑒于作者總說(shuō)自己用到的統(tǒng)計(jì)和分析軟件為SPSS和Graphpad(即使在單細(xì)胞模塊也是)死相，那可能單細(xì)胞這部分?jǐn)?shù)據(jù)分析工作的完成另有其人。

這里作者利用ssGSEA對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)分(單細(xì)胞基因集評(píng)分可以看這個(gè)教程：一文搞定單細(xì)胞基因集評(píng)分)咬像，發(fā)現(xiàn)AS患者的M2評(píng)分更高一些媳纬，這其實(shí)與我以往的認(rèn)知有所不同，我的知識(shí)體系里一般覺(jué)得M1型巨噬細(xì)胞起到促炎作用施掏，會(huì)在炎癥發(fā)生時(shí)占比上升。與此同時(shí)茅糜，AS的成骨相關(guān)基因集評(píng)分要高于正常人七芭。

這時(shí)作者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊的亞群0，通過(guò)富集分析發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)成骨分化的形式與AS疾病發(fā)展相關(guān)蔑赘，并且發(fā)現(xiàn)亞群10(M2型巨噬細(xì)胞)可以通過(guò)VEGFA配體與亞群0的NRP1狸驳、NRP2完成細(xì)胞通訊過(guò)程。

為了驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)缩赛，作者收集了AS患者和正常人的血清耙箍、單核細(xì)胞和腰椎骨折病人的腰椎韌帶組織，利用ELISA酥馍、WB辩昆、RT-qPCR和IHC技術(shù)對(duì)VEGFA進(jìn)行了檢測(cè)≈继唬可以看出VEGFA在AS患者當(dāng)中明顯升高汁针，并且表達(dá)VEGFA的細(xì)胞從形態(tài)上來(lái)說(shuō)也較接近巨噬細(xì)胞。

既然已經(jīng)觀察到了巨噬細(xì)胞與AS之間的伴隨關(guān)系砚尽，接下來(lái)作者就涉及實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的探討了其中的機(jī)制施无。作者提取單核細(xì)胞誘導(dǎo)為M2細(xì)胞后添加TMF-α誘導(dǎo)VEGFA的表達(dá)并與韌帶組織中提取出的間充質(zhì)干細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)這種共孵育會(huì)導(dǎo)致間充質(zhì)肝臟細(xì)胞的成骨分化能力上升必孤。

這種成骨能力也會(huì)隨著VEGFA濃度的上升而上升：

之后作者通過(guò)GO分析找到了0亞群中NRP關(guān)聯(lián)基因及VEGF下游信號(hào)通路猾骡，并通過(guò)WB發(fā)現(xiàn)VEGFA介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化是由P-Akt通路所引起的：

既然通路找到了，作者就開始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)試圖從體內(nèi)外驗(yàn)證VEGFA→VEGFR2→P-Akt對(duì)異位成骨的體內(nèi)外驗(yàn)證敷搪。首先在體外兴想，TNF-α的刺激能夠促進(jìn)AS向M2的形式分化，分泌VEGFA刺激韌帶干細(xì)胞的成骨分化购啄，但在通過(guò)siRNA對(duì)VEGFA進(jìn)行干擾后襟企，巨噬細(xì)胞的促成骨能力明顯下降。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中狮含，作者在蛋白聚糖誘導(dǎo)的AS小鼠動(dòng)物模型中通過(guò)VEGFR2抑制劑(Ki8751)的使用能夠緩解AS進(jìn)展：

這個(gè)工作十分的完整顽悼，可謂是從表型曼振、數(shù)據(jù)挖掘、機(jī)制尋找蔚龙、體內(nèi)外驗(yàn)證幾個(gè)方面打通了這個(gè)課題冰评。如果硬要挑骨頭，就是拿SPSS分析GO富集的差異讓人懷疑數(shù)據(jù)處理這部分是外包的木羹，但論文完成方式如何并不會(huì)影響這篇論文的完成度與價(jià)值甲雅！另外，這篇文章的數(shù)據(jù)模塊占比并不高坑填，單細(xì)胞測(cè)序只是一個(gè)引子抛人。

第二篇

這篇是來(lái)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的名為“單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組解析食管癌發(fā)生多階段過(guò)程中上皮及基質(zhì)微環(huán)境動(dòng)態(tài)變化”的文章，于2022年5月答辯脐瑰，算是最新的一批相關(guān)文章[2]妖枚。該畢業(yè)論文全長(zhǎng)97頁(yè)，掐頭去尾(去除目錄苍在、聲明绝页、致謝等內(nèi)容)僅88頁(yè)內(nèi)容。論篇幅還低于我們上次碩士篇中某些論文寂恬，但這篇學(xué)術(shù)論文的主要內(nèi)容于2022年發(fā)表在《Cancer Research》上(IF=13)[3]续誉。這位博士的專業(yè)腫瘤學(xué)(基礎(chǔ))，應(yīng)當(dāng)是19年博士入學(xué)初肉，22年畢業(yè)(三年制的博士酷鸦，好吧，又是我羨慕的)牙咏，在學(xué)期間以共同第一作者共發(fā)表了2篇SCI(另一篇為2020年的《Nature Communications》, IF=14.9)[4]井佑、1篇中文論文。

來(lái)具體看一下內(nèi)容眠寿，值得注意的是躬翁，這是一篇以數(shù)據(jù)分析為主的論文。食管鱗狀細(xì)胞癌不是我們討論的重點(diǎn)盯拱，不作介紹盒发，作者在河南林州食管癌研究現(xiàn)場(chǎng)收集了14名患者食管多階段病變組織標(biāo)本，包括8例正常鱗狀上皮狡逢、8例炎癥上皮宁舰、6例低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、9例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和14例食管鱗癌組織奢浑，進(jìn)行了10X 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(這個(gè)數(shù)量的臨床單細(xì)胞測(cè)序蛮艰，價(jià)值真的很高)。

對(duì)于建庫(kù)與數(shù)據(jù)處理這部分內(nèi)容雀彼，作者描述的較為詳細(xì)壤蚜，看起來(lái)數(shù)據(jù)這部分內(nèi)容是其自行完成(這可能也是這篇文章主要內(nèi)容為數(shù)據(jù)分析的原因即寡，確實(shí)需要花費(fèi)大量時(shí)間)。作者首先通過(guò)病理切片觀察了一些病理特征袜刷，之后通過(guò)Seurat進(jìn)行初步數(shù)據(jù)分析并注釋得到細(xì)胞類群聪富，觀察其中的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的比例著蟹，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)加以驗(yàn)證墩蔓。

在作者課題組此前的研究中，發(fā)現(xiàn)有八個(gè)上皮細(xì)胞表達(dá)程序與正常上皮細(xì)胞演化為具有侵襲性惡性表型的癌細(xì)胞相關(guān)萧豆。通過(guò)單細(xì)胞的數(shù)據(jù)作者也重現(xiàn)了這一表達(dá)特征奸披，并發(fā)現(xiàn)了這八個(gè)上皮細(xì)胞表達(dá)程序的互斥性：

作者進(jìn)一步對(duì)比了細(xì)胞增殖程序、細(xì)胞抗氧化程序涮雷、分化程序源内、黏膜免疫程序在各階段中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在HGIN階段中這四個(gè)程序發(fā)生了明顯改變份殿，其中的一些基因也發(fā)生了梯度的變化：

接下來(lái)作者通過(guò)軌跡推斷(也就是擬時(shí)序分析，monocle2教程可以看這里單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)階分析—《擬時(shí)序分析》3.monocle2實(shí)操：完整版)進(jìn)一步描繪不同病理階段上皮細(xì)胞的相互關(guān)聯(lián)性嗽交，發(fā)現(xiàn)正常上皮細(xì)胞在向腫瘤細(xì)胞進(jìn)化的過(guò)程中會(huì)逐漸出現(xiàn)兩個(gè)獨(dú)立的特征卿嘲。

不僅是上皮細(xì)胞，作者將內(nèi)皮細(xì)胞分為了兩個(gè)亞群：腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞(TEC)和正常內(nèi)皮細(xì)胞(NEC)夫壁，通過(guò)差異分析及火山圖可視化發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)的基因主要與細(xì)胞外基質(zhì)重塑拾枣、血管生成、脈管系統(tǒng)生成盒让、腫瘤侵襲梅肤、細(xì)胞粘附等過(guò)程相關(guān)(emm，也許這里少一個(gè)富集分析邑茄？)姨蝴。

考慮到成纖維細(xì)胞的高度異質(zhì)性，作者一共獲得了四個(gè)類群(正常黏膜成纖維細(xì)胞,NMF肺缕；正匙笠剑活化成纖維細(xì)胞,NAF； 癌相關(guān)成纖維細(xì)胞同木；血管平滑肌細(xì)胞, VSMC)浮梢。這些細(xì)胞具有各自的marker與特征通路：

為了進(jìn)一步探究這四種成纖維細(xì)胞亞群在癌發(fā)生過(guò)程中的潛在功能應(yīng)用，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)各個(gè)階段不同成纖維細(xì)胞類型的比例也會(huì)有所不同彤路。并且通過(guò)擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)這些具有不同功能的成纖維細(xì)胞可能存在相互轉(zhuǎn)化秕硝。

成纖維細(xì)胞異質(zhì)性很高，不同的細(xì)胞亞群可能對(duì)腫瘤具有不同的作用(促進(jìn)或抑制)洲尊。因此作者通過(guò)細(xì)胞通訊試圖揭示其與上皮細(xì)胞之間的相互做作用远豺，以解析癌相關(guān)成纖維細(xì)胞在微環(huán)境中與腫瘤浸潤(rùn)性上皮細(xì)胞的促轉(zhuǎn)移機(jī)制奈偏。通過(guò)CellphoneDB(為啥都喜歡用CellphoneDB，我還是覺(jué)得CellChat是yyds：單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)階分析—《細(xì)胞通訊》2.2CellChat多組別分析)的計(jì)算憋飞，發(fā)現(xiàn)CAF細(xì)胞群與上皮細(xì)胞之前存在多對(duì)顯著相互作用霎苗，可能通過(guò)CD74-MIF、EGFR-MIF榛做、HLA-C-FAM3C發(fā)生相互作用從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)唁盏、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移检眯、惡變細(xì)胞極性丟失等表型從而進(jìn)一步調(diào)控腫瘤發(fā)生厘擂。

此后作者對(duì)其中一些關(guān)鍵通路、基因與NAF及CAF細(xì)胞比例展開了相關(guān)性分析并加以討論锰瘸，這篇文章的主體內(nèi)容便結(jié)束了刽严。

最后

除了這兩篇之外我還讀了一篇博士論文，該論文的篇幅也在一百頁(yè)左右避凝，主要內(nèi)容是20只不同分組的模式動(dòng)物的單細(xì)胞測(cè)序分析舞萄，并且沒(méi)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證內(nèi)容(包含一些臨床樣本的免疫熒光驗(yàn)證)。最終該畢業(yè)論文的主題內(nèi)容也是發(fā)在了一個(gè)IF=11.3的期刊上管削。所以倒脓，沒(méi)有必要再讀下去了，這三篇文章以及上次的碩士篇含思，給我的感受就是：有好文章崎弃，不怕畢不了業(yè)。

參考文獻(xiàn)

[1]馮新哲. 基于單細(xì)胞測(cè)序探究強(qiáng)直性脊柱炎炎癥和骨化進(jìn)程中巨噬細(xì)胞和干細(xì)胞的交互關(guān)系[D].中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué),2021.[2]林霖. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組解析食管癌發(fā)生多階段過(guò)程中上皮及基質(zhì)微環(huán)境動(dòng)態(tài)變化[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2022.[3]Liu T, Zhao X, Lin Y, Luo Q, Zhang S, Xi Y, Chen Y, Lin L, Fan W, Yang J, Ma Y, Maity AK, Huang Y, Wang J, Chang J, Lin D, Teschendorff AE, Wu C. Computational Identification of Preneoplastic Cells Displaying High Stemness and Risk of Cancer Progression. Cancer Res. 2022 Jul 18;82(14):2520-2537.[4]Yao J, Cui Q, Fan W, Ma Y, Chen Y, Liu T, Zhang X, Xi Y, Wang C, Peng L, Luo Y, Lin A, Guo W, Lin L, Lin Y, Tan W, Lin D, Wu C, Wang J. Single-cell transcriptomic analysis in a mouse model deciphers cell transition states in the multistep development of esophageal cancer. Nat Commun. 2020 Jul 24;11(1):3715. [圖片上傳失敗...(image-7e6706-1693140579846)]