單細(xì)胞測(cè)序&空間轉(zhuǎn)錄組猿诸，雙劍合璧卫玖，誰(shuí)與爭(zhēng)鋒
編輯：ANIMUS
校對(duì)：ANIMUS
編者按：2020年初一場(chǎng)猝不及防的新冠肺炎疫情徹底改變了這個(gè)世界糟趾，也改變了我們每個(gè)人的工作和生活。傳染性呼吸系統(tǒng)病毒和疾病從未真正停止過(guò)休雌，比如2003年的SARS灶壶，2015年的MERS和2020年的SARS-CoV-2。對(duì)于呼吸道感染相關(guān)病原菌及其宿主免疫機(jī)制的研究對(duì)于基礎(chǔ)科研和公共衛(wèi)生具有重大戰(zhàn)略意義杈曲。
愛(ài)麗慕斯學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)專注于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)前沿進(jìn)展驰凛，探索心腦血管疾病和癌癥等的致病基因、發(fā)病機(jī)制和藥物開發(fā)等担扑。這里解讀應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)恰响，研究流感病毒感染肺組織的免疫分子機(jī)制，助力呼吸系統(tǒng)疾病前沿進(jìn)展共享涌献。
嚴(yán)重呼吸道感染可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)胚宦。目前尚無(wú)有效藥物可改善ARDS患者預(yù)后。宿主炎癥反應(yīng)限制了病原體擴(kuò)散并最終清除病原體，但免疫病理反應(yīng)也導(dǎo)致了組織損傷和ARDS枢劝。呼吸道感染是導(dǎo)致疾病和死亡的主要原因井联。這些感染可導(dǎo)致ARDS并發(fā)肺水腫和缺氧，導(dǎo)致輕度到重度呼吸衰竭您旁。病毒感染引起的肺損傷主要是由于免疫細(xì)胞浸潤(rùn)烙常，它殺死了感染細(xì)胞和周圍正常細(xì)胞。因此鹤盒，深入研究病原體清除和免疫病理之間的平衡蚕脏，可能有助于尋找改善ARDS2預(yù)后的策略。
2020年10月28日侦锯，Nature在線發(fā)表了由美國(guó)田納西州孟菲斯市圣猶大兒童研究醫(yī)院免疫學(xué)系Paul G. Thomas和Jeremy Chase Crawford蝗锥，與廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院廣州呼吸健康研究所鐘南山院士合作的文章，“Exuberant fibroblast activity compromises lung function viaADAMTS4”率触，利用10X單細(xì)胞測(cè)序，結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組汇竭，揭示了過(guò)度的成纖維細(xì)胞活性通過(guò)ADAMTS4損害肺功能葱蝗，并提出ADAMTS4可作為病原菌感染的治療靶點(diǎn)。
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一两曼、甲流病毒感染小鼠后CD45-細(xì)胞的單細(xì)胞基因表達(dá)譜
研究者采集了感染甲流病毒0天、1天玻驻、3天和6天的小鼠肺組織悼凑，分選CD45-細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，鑒定到三個(gè)主要細(xì)胞群：成纖維細(xì)胞璧瞬、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(圖1 a&b)户辫。病毒mRNA的高表達(dá)，表明細(xì)胞受到高效感染嗤锉，主要出現(xiàn)在I型肺細(xì)胞,纖毛上皮細(xì)胞和II型肺細(xì)胞渔欢。
成纖維細(xì)胞在感染后出現(xiàn)多種轉(zhuǎn)錄狀態(tài)(圖1c, d)。為評(píng)估每個(gè)簇中激活的通路瘟忱，進(jìn)行基因集富集分析(GSEA)奥额，將每個(gè)簇與感染前基線簇(簇5)比較(圖1c)。根據(jù)基因表達(dá)特點(diǎn)访诱，鑒定了三個(gè)主要功能：靜息（resting）垫挨、ECM合成和炎癥(圖1c)。ECM成纖維細(xì)胞(ESFibs)中富集到編碼ECM結(jié)構(gòu)蛋白的基因触菜，但缺乏炎癥信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)(圖1d)九榔。炎性成纖維細(xì)胞高表達(dá)炎癥相關(guān)基因，而靜息成纖維細(xì)胞沒(méi)有顯著富集通路，主要涉及炎癥反應(yīng)或ECM合成(圖1e)帚屉。
在炎性成纖維細(xì)胞中谜诫，鑒定出兩種不同的激活狀態(tài)，損傷反應(yīng)成纖維細(xì)胞(DRFibs)和干擾素反應(yīng)成纖維細(xì)胞(IRFibs)(圖1d)攻旦。最后通過(guò)分析五個(gè)人肺組織活檢發(fā)現(xiàn)人成纖維細(xì)胞活化狀態(tài)與小鼠的類似喻旷。
二、誰(shuí)在調(diào)控成纖維細(xì)胞激活牢屋？
為尋找調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞激活的上游刺激因素且预，作者研究了人季節(jié)性病毒(H3N2)或禽流感病毒(H5N6或H7N9) 體外感染正常人支氣管上皮細(xì)胞(NHBEs)是否足以在共培養(yǎng)的人肺成纖維細(xì)胞中，產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)(圖2a)烙无。NHBEs感染后誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞中大量炎癥基因表達(dá)锋谐，包括編碼細(xì)胞因子的基因(IL6)和幾種基質(zhì)蛋白酶(ADAMTS4,MMP3和MMP13)。作者還關(guān)注了單個(gè)細(xì)胞因子和流感病毒在其自身培養(yǎng)的呼吸道細(xì)胞中引發(fā)的這些炎癥信號(hào) (圖2a截酷，單培養(yǎng))涮拗，并將它們與流感病毒感染者的鼻腔清洗細(xì)胞(主要包括免疫細(xì)胞)進(jìn)行比較。與NHBEs相比迂苛，成纖維細(xì)胞對(duì)IL-1細(xì)胞因子家族和TNF的刺激反應(yīng)強(qiáng)烈三热，ECM相關(guān)基因廣泛上調(diào)(圖2a)。洗鼻細(xì)胞中ECM相關(guān)基因結(jié)構(gòu)蛋白和基質(zhì)蛋白酶低表達(dá)三幻。
然而就漾，鼻洗液和上皮細(xì)胞也表現(xiàn)出IL1A、IL1B和TNF高表達(dá)念搬，表明它們可能向成纖維細(xì)胞傳遞免疫信號(hào)抑堡，從而調(diào)節(jié)ECM相關(guān)基因表達(dá)。
a首妖，相對(duì)于mock對(duì)照組，感染組中基因表達(dá)（log2轉(zhuǎn)換后）平均變化倍數(shù)荣倾。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中悯搔，每列代表一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。對(duì)于單培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)舌仍，每列表示兩次重復(fù)刺激獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值妒貌。
三、流感病毒感染后不同時(shí)間段的小鼠肺組織ECM蛋白酶的表達(dá)譜
為探索蛋白酶在肺修復(fù)中的作用铸豁，作者收集了流感病毒感染后不同時(shí)間段的小鼠肺組織勻漿灌曙，鑒定了ECM相關(guān)基因的表達(dá)(圖3)。ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中ECM蛋白酶和組織抑制金屬蛋白酶(TIMPs)的表達(dá)量节芥。ECM蛋白酶中在刺，最早受誘導(dǎo)表達(dá)的是ADAMTS4——降解蛋白多糖versican的酶之一逆害，其表達(dá)持續(xù)貫穿整個(gè)修復(fù)階段(圖3)。
根據(jù)scRNA-seq蚣驼，ADAMTS4的表達(dá)僅限于非免疫的基質(zhì)細(xì)胞(圖4c)魄幕。接下來(lái)作者對(duì)感染前后的免疫和非免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行了分類。感染前颖杏，ADAMTS4基因僅在成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)纯陨。感染后，僅在成纖維細(xì)胞中觀察到ADAMTS4表達(dá)量顯著上調(diào)留储，作者認(rèn)為這解釋了感染肺部中ADAMTS4的大量表達(dá)(圖2d)翼抠。
Meta分析顯示，在人類肺部疾病的一些數(shù)據(jù)集中获讳，與健康對(duì)照組織相比阴颖，炎性肺疾病組織中ADAMTS4的表達(dá)顯著增加。
四损晤、流感病毒感染后小鼠肺組織的空間基因表達(dá)譜
作者在呼吸窘迫高峰期(感染后10天(dpi))收集小鼠肺切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組，無(wú)監(jiān)督聚類識(shí)別出肺部區(qū)域(紅色红竭，簇0)與間質(zhì)炎癥區(qū)域重疊(圖5)尤勋。與DRFibs相關(guān)的基因，包括ITGA5茵宪、LOX和ADAMTS4，在這些區(qū)域富集(圖5)。ADAMTS4的表達(dá)局限于肺泡附近的間質(zhì)炎癥區(qū)吹榴。DRFib相關(guān)基因在支氣管區(qū)域(綠色肌厨，簇2)、淋巴高浸潤(rùn)區(qū)(青色凰狞，簇3)和正常肺泡薄壁組織(黃色篇裁，簇1)低表達(dá)或不表達(dá)∩娜簦總之达布，這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)宿主感染病毒后開始恢復(fù)或病情惡化時(shí)逾冬，氣管遠(yuǎn)端表達(dá)ADAMTS4的DRFibs發(fā)揮了重要作用黍聂。
五、ADAMTS4促進(jìn)致命性免疫病理反應(yīng)
為深入研究ADAMTS4對(duì)感染結(jié)果的影響产还，作者用致死劑量的甲型流感病毒對(duì)ADAMTS4野生型（WT）和ADAMTS4KO（KO）小鼠進(jìn)行試驗(yàn)匹厘。相比WT小鼠，ADAMTS4KO老鼠生存率顯著提高（圖6a）脐区，肺部病毒感染區(qū)域面積無(wú)顯著差異（圖6b）愈诚，動(dòng)脈氧飽和度更高，肺功能更好（圖6c & e）坡椒。在9 dpi時(shí)扰路，ADAMTS4?KO小鼠的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡炎癥顯著減少，肺組織損傷程度較小(圖3d)倔叼。
a丈攒，甲型流感病毒感染小鼠(WT, n=33, KO, n=23)的生存曲線哩罪。b，感染小鼠肺的代表性圖像和病毒傳播的定量巡验。感染區(qū)域用紅色標(biāo)出; c际插，3和6 dpi時(shí)動(dòng)脈血氧飽和度(SpO2)。d显设，接近致死劑量病毒感染9 dpi時(shí)代表性圖像和組織學(xué)評(píng)分框弛。e，接近致死劑量病毒感染氣道阻力捕捂。
六瑟枫、ADAMTS4是人類流感感染的預(yù)測(cè)因子
作者在3個(gè)隊(duì)列中研究ADAMTS4對(duì)嚴(yán)重流感病毒感染的影響和作用。首先指攒，基于兒童重癥流感(PICFLU)網(wǎng)絡(luò)中84名流感病毒感染兒童的多中心隊(duì)列慷妙，采集兒童重癥監(jiān)護(hù)入院后72小時(shí)內(nèi)收集的氣管內(nèi)吸氣(ETA)樣本，分析了ECM蛋白酶和TIMPs水平允悦。作者發(fā)現(xiàn)ADAMTS4與IL-1B和TNF水平呈正相關(guān)膝擂，而IL-1B和TNF是ADAMTS4表達(dá)的上游調(diào)節(jié)因子。
作者分析兒童隊(duì)列（PICFLU）發(fā)現(xiàn)ADAMTS4水平與相關(guān)疾病的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)隙弛。而2個(gè)成人隊(duì)列（廣州隊(duì)列和臺(tái)灣隊(duì)列）中ECM蛋白酶架馋、TIMP和細(xì)胞因子的調(diào)控模式與兒童隊(duì)列相似(圖7c)。并且全闷，ADAMTS4主要位于下呼吸道中绩蜻。
最后，作者分析后提出室埋，下呼吸道中ADAMTS4蛋白水平是嚴(yán)重流感病毒感染后低氧呼吸衰竭和大范圍死亡的強(qiáng)有力預(yù)測(cè)因子(OR = 2.22, P = 3.1 × 10?5)办绝。
a, PICFLU隊(duì)列分析物的相關(guān)矩陣。對(duì)于每個(gè)兩兩比較孕蝉，顏色表示斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)屡律，而方框大小表示顯著性水平。分析物按層次聚類進(jìn)行排序降淮。b超埋，以性別、既往健康佳鳖、年齡和類固醇治療為協(xié)變量的VFD < 10的優(yōu)勢(shì)比霍殴。c，臺(tái)灣和廣州隊(duì)列中每個(gè)患者從第一個(gè)可用時(shí)間點(diǎn)分析物的相關(guān)矩陣系吩。d来庭，以性別和年齡為潛在協(xié)變量的VFD < 10的比值比。b穿挨、d的優(yōu)勢(shì)比采用多重檢驗(yàn)的logistic回歸與FDR校正;陽(yáng)性(紅色)或陰性(藍(lán)色)相關(guān)月弛。
七、總結(jié)
本研究結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序（scRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄組（ST）科盛，研究了甲流病毒感染小鼠后CD45-細(xì)胞的單細(xì)胞和組織空間基因表達(dá)譜帽衙，發(fā)現(xiàn)呼吸道病毒感染誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞的三種不同激活狀態(tài)，即細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成贞绵，損傷反應(yīng)和干擾素反應(yīng)狀態(tài)厉萝。嚴(yán)重流感病毒感染時(shí)，肺成纖維細(xì)胞的過(guò)度活化可導(dǎo)致致命的免疫病理反應(yīng)榨崩。通過(guò)產(chǎn)生ECM重構(gòu)酶——特別是ECM蛋白酶ADAMTS4和炎癥細(xì)胞因子冀泻，損傷反應(yīng)成纖維細(xì)胞以損害肺功能為代價(jià)，改變了肺微環(huán)境以提高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)蜡饵。在三組呼吸道疾病隊(duì)列中，下呼吸道ADAMTS4水平與季節(jié)性或禽流感病毒感染的嚴(yán)重程度相關(guān)胳施。靶向損傷反應(yīng)性肺成纖維細(xì)胞ECM蛋白酶活性的治療藥物溯祸，可能為重癥呼吸道感染后保護(hù)肺功能和改善臨床結(jié)果提供新方案。
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參考文獻(xiàn)
1. Boyd David F, Allen E Kaitlynn, Randolph Adrienne G et al. Exuberant fibroblast activity compromises lung function via ADAMTS4. Nature, 2020, 587: 466-471.
