目前10X空間轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)有了很多的意向，但是對(duì)于空間轉(zhuǎn)錄組的帶給我們的位置信息想要告訴我們什么樣的結(jié)果吆你，仍缺乏引導(dǎo)胧后，如何運(yùn)用空間轉(zhuǎn)錄組，更多需要我們自己的摸索和一些文獻(xiàn)帶給我們一些思路科盛，今天我們來(lái)分享一篇空間轉(zhuǎn)錄組文章帽衙，Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma，今年7月份發(fā)布于cell贞绵。
摘要
為了定義皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cSCC）的細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)厉萝，我們將單細(xì)胞RNA測(cè)序與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和來(lái)自一系列人cSCCs和匹配的正常皮膚的多重離子束成像相結(jié)合。cSCC表現(xiàn)出四個(gè)腫瘤亞群，三個(gè)概括正常的表皮狀態(tài)以及一個(gè)腫瘤特有的腫瘤特異性角質(zhì)形成細(xì)胞（TSK）群體谴垫，其定位于纖維血管利基章母，單細(xì)胞和空間數(shù)據(jù)映射的配體-受體網(wǎng)絡(luò)與特定細(xì)胞類(lèi)型的整合，揭示了TSK細(xì)胞是細(xì)胞間通訊的樞紐弹渔，免疫抑制的多種特征被發(fā)現(xiàn)胳施，包括T調(diào)節(jié)細(xì)胞（Treg）與CD8 T細(xì)胞在間隔腫瘤基質(zhì)中的共定位。最后肢专，人類(lèi)腫瘤異種移植物的單細(xì)胞表征和體內(nèi)CRISPR篩選確定了特定的腫瘤亞群富集基因網(wǎng)絡(luò)在腫瘤發(fā)生中的重要作用舞肆。這些數(shù)據(jù)定義了cSCC腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞亞群，它們相互作用的空間位點(diǎn)以及它們參與癌癥的交流基因網(wǎng)絡(luò)博杖。
背景
（1）人類(lèi)惡性腫瘤 ------- 90%是上皮癌 ------- 皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cSCC）具有原型特征椿胯，例如組織極性破壞和基底膜浸潤(rùn)，因此可作為原型剃根。
（2）腫瘤異質(zhì)性哩盲，切除癌變部位淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，PD-1治療出現(xiàn)的耐藥性等狈醉，突出了對(duì)于cSCC腫瘤微環(huán)境研究的迫切性廉油。
（3）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表征細(xì)胞類(lèi)型，研究耐藥性苗傅，但是于正常組織相比抒线，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組缺少能夠識(shí)別腫瘤特有的生物學(xué)特征和腫瘤空間的異質(zhì)性!
研究思路.png
從思路圖上看，作者結(jié)合了單細(xì)胞渣慕，空間等技術(shù)嘶炭，來(lái)闡明cSCC的腫瘤微環(huán)境，利用了單細(xì)胞分辨率高逊桦，空間轉(zhuǎn)錄組識(shí)別空間定位等技術(shù)的優(yōu)勢(shì)眨猎，從多個(gè)角度來(lái)認(rèn)知cSCC的腫瘤微環(huán)境接下來(lái)我們來(lái)看一下作者得到的主要結(jié)果。
主要結(jié)果（1）cSCC的多模式分析
利用單細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)
O9$85V0($FQ4ER55$~U2TUO.png
值得注意的地方
一强经、關(guān)于細(xì)胞定義睡陪，從作者的思路來(lái)看，拿到這么多的細(xì)胞聚類(lèi)結(jié)果匿情，首先定義大類(lèi)兰迫，作者單細(xì)胞拿到5萬(wàn)多個(gè)細(xì)胞，初次定義僅僅定義了6類(lèi)码秉，然后再對(duì)各個(gè)大類(lèi)有一個(gè)小類(lèi)的劃分逮矛，思路很值得借鑒鸡号。
二转砖、批次效應(yīng)的理解，作者的樣本包括癌癥樣本和正常樣本，不同樣本之間的聚類(lèi)分析得到的結(jié)果府蔗，是否含有批次效應(yīng)晋控，作者給出了一定的解答。首先姓赤，不同樣本的測(cè)序深度應(yīng)當(dāng)大致相同赡译，差異過(guò)大在分析的過(guò)程中（主要是normalize這一步），會(huì)增大批次效應(yīng)不铆，得到非生物學(xué)的結(jié)果蝌焚。其次，與之前的結(jié)果進(jìn)行比較誓斥，all bearing resemblance to subsets from prior solid tumor scRNA-seq studies只洒，研究的一致性也會(huì)體現(xiàn)技術(shù)的穩(wěn)定性，我們來(lái)看一下作者樣本的情況劳坑。
3K_`1~A0GU2RGHCY2(12TVN.png
從這張圖圖片可以看出毕谴，腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞存在明顯的區(qū)域劃分，這里我們就需要注意了距芬，相信很多做單細(xì)胞的研究者而言涝开，遇到這樣的結(jié)果，會(huì)認(rèn)為是批次效應(yīng)框仔，用一定的生信方法去去除（典型如Seurat舀武，存在過(guò)矯正的問(wèn)題），所以說(shuō)批次效應(yīng)的驗(yàn)證存和，是一個(gè)很大的課題奕剃。
Taken together,these data provide a representative cellular atlas for cSCC.
主要結(jié)果（2）TSK亞群
圖片.png
對(duì)正常和腫瘤的上皮細(xì)胞分開(kāi)進(jìn)行re-clustering，正常細(xì)胞分為三種細(xì)胞類(lèi)型捐腿，including (1) basal (COL17A1), (2)cycling (MKI67), and (3) differentiating (KRT1) cells纵朋，腫瘤樣本出現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)有的細(xì)胞類(lèi)型TSK，下圖可以看出茄袖，從相關(guān)性分析的結(jié)果來(lái)看操软，TSK與其他類(lèi)型相關(guān)性都很低，以此作為一個(gè)證據(jù)來(lái)證明這是一個(gè)新的細(xì)胞類(lèi)型宪祥。
correction.png
接下來(lái)是對(duì)TSK細(xì)胞類(lèi)群的特征性分析：
（1） TSKs表達(dá)經(jīng)典的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）markers
（2）Furthermore, TSKs exhibited the highest expression of the Hallmark EMT gene signature（GSVA）
（3）EMT-like TSK cells lacked expression of classic EMT transcription factors (TFs)聂薪，Therefore, we performed single-cell regulatory network inference and clustering(SCENIC)，which nominated AP1 and ETS family members as TFs potentially controlling TSKs蝗羊。（suggesting high cell state plasticity）藏澳。
（4）最后，我們發(fā)現(xiàn)基底腫瘤細(xì)胞在正常組織中的增殖頻率大約是基底細(xì)胞的五倍耀找，相反翔悠，腫瘤和正常分化的KC在cycling中沒(méi)有差異业崖，可能反映了終末分化中細(xì)胞周期退出的要求，TSK cells cycled the least frequently in tumors (8%), and basal cells were approximately four times more common in tumor than normal cycling cells蓄愁，總之双炕，這些數(shù)據(jù)表明cSCC中的表皮分化層次在關(guān)鍵方面失調(diào)：（1）無(wú)法完全參與分化，（2）基底細(xì)胞迅速增殖撮抓，以及（3）表達(dá)EMT-link基因的TSK亞群的出現(xiàn)妇斤。
值得關(guān)注的方面
一、對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行re-cluster為什么不把腫瘤和正常細(xì)胞全部放在一起呢丹拯？作者的做法是分別對(duì)正常和腫瘤進(jìn)行重新聚類(lèi)站超，定義之后發(fā)現(xiàn)了一群新的類(lèi)群，大家可以思考一下乖酬， 如果換作我們來(lái)分析顷编，是不是在整合的道路上一條道走到黑呢？
二剑刑、細(xì)胞增殖頻率是怎么計(jì)算的媳纬？這里留下這樣的疑問(wèn)，如果感興趣施掏，可以深入研究一下钮惠，后面會(huì)給大家一起分享一些見(jiàn)解。
三七芭、新的細(xì)胞類(lèi)型如何識(shí)別素挽，如果我們拿到作者給出的結(jié)果，是否有膽量把TSK作為一個(gè)新的細(xì)胞類(lèi)型定義出來(lái)進(jìn)行后續(xù)的全部分析呢狸驳？這里就涉及到新的細(xì)胞類(lèi)型如何驗(yàn)證的問(wèn)題预明，以作者的結(jié)果為例，定義用了marker耙箍，有一群無(wú)法被識(shí)別撰糠，如何印證？1辩昆、相關(guān)性分析阅酪，2、通路富集分析的差異汁针，3术辐、TF因子分析（基因表達(dá)潛能），這些用法均可以作為我們做分析的可靠思路施无。
主要結(jié)果（3）Spatial Transcriptomics Identifies TSK-Basal Heterogeneity at the Leading Edge
這里的空間轉(zhuǎn)錄組作者主要是對(duì)一種細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行空間異質(zhì)性的研究辉词，讓我們來(lái)看看空間轉(zhuǎn)錄組是如何利用的。
患者中猾骡，與腫瘤相關(guān)的spot在scRNA-seq中顯示了映射到腫瘤KC的基因表達(dá)瑞躺，而免疫或基質(zhì)基因與鄰近腫瘤的基質(zhì)隧魄，未涉及的基質(zhì)或附件區(qū)域相關(guān)，與總體組織學(xué)cSCC結(jié)構(gòu)一致（那也就是說(shuō)隘蝎，空間位置信息首先是用來(lái)映射基因表達(dá)，表征細(xì)胞大類(lèi)襟企，例如腫瘤嘱么，正常組織，這是第一步顽悼，也就是說(shuō)曼振，每個(gè)基因空間位置的表達(dá)我們可以得到）。這里需要注意的是（如下圖）蔚龙，空間spot是進(jìn)行空間聚類(lèi)的冰评，這樣的做法類(lèi)似于單細(xì)胞的分析，后續(xù)會(huì)用到這個(gè)聚類(lèi)結(jié)果木羹。
空間組織.png
第一步：Scoring spots in each section with TSK-signature genes fromscRNA-seq
作者這里對(duì)空間spot聚類(lèi)的結(jié)果（cluster）甲雅，對(duì)單細(xì)胞識(shí)別的TSK的signature genes進(jìn)行Scoring，發(fā)現(xiàn)一個(gè)明顯有富集作用的cluster（如下圖）坑填，including the TSK markerMMP10, in each patient抛人。TheseTSK-high clusters were similar across patients（也就是說(shuō)作者運(yùn)用的是對(duì)空間聚類(lèi)的富集）
violin.png
In tumors with clear leading edges, the TSK-adjacent stroma，was enriched
for cancer-associated fibroblast (CAF) and endothelial transcripts, highlighting a fibrovascular niche脐瑰。（如下圖）也就是說(shuō)妖枚，在空間上識(shí)別了感興趣的細(xì)胞類(lèi)型之后，研究其周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞的特征苍在，這里要注意對(duì)周?chē)?xì)胞（spot）的挑選方法绝页，以此來(lái)得到空間位置的相關(guān)信息。
violin.png
超過(guò)80％的TSKspot位于腫瘤的前緣（這里可以看到空間的分布寂恬，結(jié)合之前對(duì)腫瘤和正常細(xì)胞的識(shí)別续誉，突出新的細(xì)胞類(lèi)型的空間特異性），剩下的腫瘤邊緣的spot對(duì)basal tumor gene有富集效果（也就是說(shuō)作者很關(guān)注tumor和normal交界處的細(xì)胞）初肉，熒光染色也證明了這一點(diǎn)（COL17A1, a shared tumor basal and TSK marker）屈芜。炎性反應(yīng)和干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在非TSK前沿表達(dá)（不是位于腫瘤邊緣的TSKspot），總的來(lái)說(shuō)朴译，這些數(shù)據(jù)確定了由TSK和基底腫瘤細(xì)胞以及TSK近端纖維血管生境組成的異質(zhì)cSCC腫瘤邊緣（空間位置的反應(yīng)）井佑。
值得關(guān)注的點(diǎn)
（1）空間位置的第一步（對(duì)于腫瘤切片），生物學(xué)上識(shí)別腫瘤區(qū)域眠寿，這一點(diǎn)對(duì)于空間識(shí)別非常重要躬翁，其他方面可以參考這個(gè)例子（如發(fā)育）。
（2）第二步盯拱，空間spot進(jìn)行聚類(lèi)分析盒发，得到cluster的信息之后例嘱，單細(xì)胞與空間的聯(lián)系也由此展開(kāi)，單細(xì)胞識(shí)別的特有的細(xì)胞類(lèi)群宁舰，用空間的cluster去富集該cluster的特異表達(dá)基因（如文章的cluster分布）拼卵，這個(gè)時(shí)候?qū)τ谛碌募?xì)胞類(lèi)型有了一個(gè)空間位置上的直觀認(rèn)識(shí)。
（3）第三步蛮艰，特有細(xì)胞類(lèi)型和腫瘤邊界形成的關(guān)系腋腮，作者專(zhuān)門(mén)挑選腫瘤邊界的spot進(jìn)行分析，也就是說(shuō)壤蚜，測(cè)序和定義結(jié)果與染色圖片進(jìn)行關(guān)聯(lián)即寡，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類(lèi)型與關(guān)注的空間位置的相互關(guān)系（例如作者發(fā)現(xiàn)TSK組成了腫瘤組織的邊界）。
（4）空間位置分布對(duì)于TSK細(xì)胞亞類(lèi)的劃分袜刷，大部分TSK位于腫瘤邊界聪富，另外一部分的TSK表達(dá)炎性反應(yīng)和干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，體現(xiàn)了空間位置對(duì)于細(xì)胞亞類(lèi)的劃分（空間位置會(huì)出現(xiàn)不同的生物學(xué)功能）著蟹。
主要結(jié)果（4）The Immune Landscape of cSCC
研究腫瘤墩蔓，免疫分析是永遠(yuǎn)的話題，無(wú)論是免疫治療還是免疫浸潤(rùn)萧豆，對(duì)于腫瘤研究而言钢拧，極具價(jià)值。
40RHX`OSYNEVO9N6BVRMBCH.png
1L5B5(C6Z}YKKWVOMH9B}S0.png
首先看這里，對(duì)病人2 進(jìn)行一個(gè)空間聚類(lèi)后，免疫基因的表達(dá)主要集中在一個(gè)cluster（5）眉尸，從空間位置上看钦椭，cluster5主要位于T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)在炎癥邊界和免疫相關(guān)簇中，接下來(lái)，通過(guò)分析scRNA-seq中的趨化因子和受體表達(dá)來(lái)評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的潛在募集機(jī)制（如下圖）
趨化因子.png
幾種趨化因子受體在重疊的T細(xì)胞亞群中高度表達(dá)，表明共同聚集并與ST中的共定位一致，免疫這部分文章講述的很精彩颂斜，總結(jié)一下重點(diǎn)：
一、免疫的研究需要很強(qiáng)的生物學(xué)背景關(guān)聯(lián)拾枣，對(duì)于免疫細(xì)胞類(lèi)型沃疮，我們需要更多的積累（marker gene，相關(guān)的配受體等等梅肤，所以做免疫研究的人司蔬，都很厲害，比如我姨蝴，哈哈）俊啼，多看看免疫相關(guān)的文獻(xiàn)， 對(duì)我們很有幫助左医。
二授帕、免疫浸潤(rùn)是一個(gè)永遠(yuǎn)的話題同木，但是對(duì)免疫起作用的不僅僅是免疫類(lèi)的細(xì)胞，還有很多其他細(xì)胞類(lèi)型在干擾免疫過(guò)程跛十，其中主要的分析思路就是相應(yīng)的配受體對(duì)（但是我們需要注意一個(gè)問(wèn)題彤路，相關(guān)的配受體對(duì)不是現(xiàn)成的，而是需要我們積累芥映，無(wú)論是數(shù)據(jù)庫(kù)還是實(shí)驗(yàn)來(lái)源洲尊，都需要我們不斷學(xué)習(xí)，不可能直接拿到想要的結(jié)果）屏轰。配受體對(duì)的分類(lèi)和影響，直接導(dǎo)致了免疫現(xiàn)象憋飞。免疫是一個(gè)大課題霎苗，大家可以認(rèn)真讀一下這一段的研究。
主要結(jié)果（5）Single-Cell Spatial Architecture of the Inflammatory TME
以單細(xì)胞分辨率剖析TIME的空間組織榛做，這部分結(jié)果用到了一項(xiàng)新技術(shù)唁盏，MIBI（離子束成像），也就是說(shuō)從單細(xì)胞水平來(lái)鑒別空間位置信息检眯，我們不作為重點(diǎn)在這里討論（腫瘤浸潤(rùn)）厘擂。
主要結(jié)果（6）Mapping Cellular Crosstalk at Leading Edge Niches
整合了scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)集以表征前沿的相鄰腫瘤與TME細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)，TSK參與了廣泛的旁分泌和自分泌的相互作用锰瘸，
配受體.png
預(yù)測(cè)在前沿調(diào)節(jié)TME特異性細(xì)胞類(lèi)型特征刽严，與TSK血管利基一致，CAF的重要TSK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是由幾個(gè)TSK-CAF配體-受體對(duì)介導(dǎo)的避凝，包括MMP9-LRP1和TNC-SDC1舞萄，另外，TSK可通過(guò)配體-受體對(duì)PGF-FLT1管削，PGF-NRP2和EFNB1-EPHB4調(diào)節(jié)內(nèi)皮倒脓。
相反，內(nèi)皮細(xì)胞和CAF顯著共表達(dá)NicheNet預(yù)測(cè)的配體含思，例如TFPI崎弃，F(xiàn)N1和THBS1，與TSK受體匹配（如下圖）：
配受體.png
NicheNet進(jìn)一步支持TSK作為類(lèi)EMT細(xì)胞類(lèi)群含潘，NicheNet預(yù)測(cè)廣泛表達(dá)的TGFB1和CAF特異性TGFB3調(diào)節(jié)TSK饲做。TSK receptors corresponding to additional ligands from TAMs and MDSCs included several integrins, including ITGA3 and ITGB1, highlighting another pathway associated with EMT and epithelial tumor invasion。
為了解決TSK細(xì)胞是否通常與TME改變有關(guān)遏弱，TCGA數(shù)據(jù)分析由單細(xì)胞數(shù)據(jù)得到的 TME gene signatures艇炎，we observed a broad correlation between TSK and CAFs in various tumor types，從基因組和轉(zhuǎn)錄組上分析腫瘤相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)腾窝，CNV loss 通常轉(zhuǎn)錄水平低缀踪，接下來(lái)居砖，我們尋求是否預(yù)測(cè)可誘導(dǎo)CAF基因的TSK配體既表現(xiàn)出（1）配體CNV缺失的腫瘤中CAF基因表達(dá)降低，（2）配體表達(dá)與CAF基因之間的相關(guān)性驴娃，確實(shí)奏候，包括MMP9，TNC唇敞，SERPINE2蔗草，CALM1和已知的CAF激活物TGFB1在內(nèi)的幾種TSK配體似乎可以誘導(dǎo)人腫瘤中的CAF（如下圖）。
tumor.png
臨床上也證明了對(duì)TSK類(lèi)群發(fā)動(dòng)治療可以提高免疫治療的效果疆柔。
需要注意的地方
這部分結(jié)果主要是對(duì)TSK與腫瘤微環(huán)境之間的相互分析咒精，可以看到作者運(yùn)用了很多的配受體對(duì)來(lái)對(duì)TSK和其他細(xì)胞類(lèi)群的交流進(jìn)行驗(yàn)證，重點(diǎn)在于這些配受體對(duì)是如何篩選的旷档，這需要很強(qiáng)的先驗(yàn)知識(shí)模叙。
接下來(lái)我們關(guān)注一下作者運(yùn)用到的生信方法：
（1）Seurat聚類(lèi)：low-resolution clustering was performed using the FindClusters function with resolution 0.1 with the first 15 PCs to generate 12 clusters.然后marker gene識(shí)別大類(lèi)。repeating dimensionality reduction and unsupervised clustering on these smaller groups of cells.For myeloid cell types, clustering at resolution 0.6（高分辨率對(duì)cluster進(jìn)行細(xì)分）鞋屈。這里需要注意的是范咨，不同的細(xì)胞類(lèi)群在重新聚類(lèi)的時(shí)候分辨率的參數(shù)是不同的，也就是說(shuō)厂庇，聚類(lèi)結(jié)果是否符合預(yù)期需要更多的摸索渠啊。注意作者的聚類(lèi)方式是ICA的方式。
（2）配受體分析权旷，配受體對(duì)的挑選替蛉。
科研無(wú)止境，文獻(xiàn)需閱讀拄氯。
