生信小課堂
研究背景：
特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種尚未明確發(fā)表機制的肺病。近年來茵休，IPF的發(fā)病率隨時間增加薪棒。壞死性凋亡是一種促炎型的程序性細胞死亡，可促進細胞內(nèi)容物的釋放以激活免疫反應(yīng)榕莺。近年來俐芯，免疫浸潤一直是癌癥研究領(lǐng)域的熱點。多種免疫細胞在肺纖維化過程中起重要作用钉鸯。
關(guān)于非腫瘤生信吧史，我們也解讀過很多，主要有以下類型
1 單個疾病WGCNA+PPI分析篩選hub基因唠雕。
2 單個疾病結(jié)合免疫浸潤贸营，熱點基因集，機器學(xué)習(xí)算法等及塘。
3 兩種相關(guān)疾病聯(lián)合分析，包括非腫瘤結(jié)合非腫瘤锐极，非腫瘤結(jié)合腫瘤或者非腫瘤結(jié)合泛癌分析
4 基于分型的非腫瘤生信分析
5 單細胞結(jié)合普通轉(zhuǎn)錄組生信分析
目前非腫瘤生信發(fā)文的門檻較低笙僚，有需要的朋友歡迎交流
流程圖：
研究結(jié)果：
一、IPF與對照間DEG和壞死性凋亡相關(guān)DEG（NRDEG）的鑒定
1灵再、差異分析前對GSE110147中的IPF組和對照組進行主成分分析(PCA)，發(fā)現(xiàn)兩組之間具有明顯的可比性。
2品山、圖2A描繪了PCA的結(jié)果路幸。隨后，通過差異分析發(fā)現(xiàn)GSE110147中IPF和對照組之間有3253個DEGs扫夜。
3、圖2B通過熱圖的可視化顯示了DEGs的表達。壞死性凋亡相關(guān)基因與GSE110147中的DEGs重疊肃拜，進一步分析29個重疊的NRDEGs。
4雌团、圖2C以維恩圖顯示29個NRDEGs燃领。
5、通過熱圖和火山圖來顯示NRDEGs的表達锦援，如圖2D, E猛蔽。
二、PPI網(wǎng)絡(luò)及功能通路分析
1灵寺、從STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建NRDEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3A)曼库。
2、基于CytoHubba MCC的算法被用來識別前10個樞紐基因(圖3B)略板，包括CFLAR毁枯、BIRC2、BIRC3蚯根、CYLD后众、TRAF5、IL1B颅拦、STAT1蒂誉、INFAR1、TICAM1和NLRP3距帅。
3右锨、對NRDEGs進行GO和KEGG富集分析，確定其生物學(xué)功能和相關(guān)信號通路(圖4A碌秸、B)绍移。
4、在分子功能中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合讥电、參與凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性和細胞因子受體結(jié)合的富集(圖4C)蹂窖。
5、KEGG分析顯示恩敌，NRDEGs富集于壞死性凋亡NOD樣受體信號通路瞬测、TNF信號通路、甲型流感、新型冠狀病毒肺炎月趟、單純皰疹病毒1型感染灯蝴、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、C型凝集素受體信號通路孝宗、丙型肝炎(圖4D)穷躁。
三、免疫浸潤及NRDEGs與免疫細胞的相關(guān)性
1因妇、通過富集分析问潭，觀察到NRDEGs主要與免疫相關(guān)信號通路相關(guān)。
2沙峻、利用ImmuCellAI算法研究了IPF中程序性壞死和免疫浸潤之間的關(guān)系睦授。結(jié)果顯示IPF組和對照組之間有12種免疫細胞類型存在顯著差異(圖5A-D)。
3摔寨、spearman相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示去枷，NRDEGs主要與巨噬細胞和中性粒細胞浸潤呈正相關(guān)，與DC細胞和NK細胞浸潤呈負相關(guān)是复，通過相關(guān)熱圖可以直觀顯示(圖5E)删顶。
四、研究NRDEGs在肺纖維II型肺泡上皮細胞中的表達
1淑廊、為了進一步探索IPF中程序性壞死與細胞類型的關(guān)系逗余，提取了GSE122960的單細胞測序數(shù)據(jù)進行分析。
2季惩、在AT II中觀察到4831個差異表達基因录粱。篩選出31個重疊的NRDEGs，包括MLKL画拾、IFNAR1和TRAF5啥繁。圖6A顯示了維恩圖可視化中的31個NRDEGs。
3青抛、通過火山圖觀察NRDEGs的表達情況旗闽，如圖6B所示。
四蜜另、預(yù)后相關(guān)樞紐基因的鑒定及預(yù)后預(yù)測模型
1适室、GSE70866包含176例IPF患者的測序數(shù)據(jù)，sva包消除了批次效應(yīng)举瑰。去除效果以PCA圖表示(圖7A, B)捣辆。
2、提取樞紐基因和預(yù)后數(shù)據(jù)的表達矩陣此迅，KM曲線顯示單因素Cox回歸分析得到的生存差異基因(圖7C-F)汽畴。
3促煮、多因素cox回歸顯示IFNAR1、TRAF5整袁、NLRP3、CYLD與預(yù)后相關(guān)佑吝。結(jié)果以森林圖的形式顯示(圖8)坐昙。作者基于多因素cox回歸的結(jié)果構(gòu)建了預(yù)后模型
4、預(yù)后模型分析顯示芋忿，與低危組相比炸客，高危組的預(yù)后明顯更差(圖9A)。
5戈钢、該生存評估模型對IPF患者預(yù)后具有較好的預(yù)測價值痹仙，AUC為0.708(圖9B)。
6殉了、本研究還基于Cox模型建立了總生存預(yù)測列線圖(圖9C)开仰。
五、NRDEGs表達及預(yù)后預(yù)測模型效果的驗證
1薪铜、通過對GSE213001的分析众弓，共發(fā)現(xiàn)27個相同的NRDEGs。27個NRDEGs中有12個基因的表達趨勢與GSE110147一致隔箍，包括BIRC2谓娃、BIRC3、CYLD蜒滩、DNM1L滨达、HSP90AA1、IL1B俯艰、NLRP3捡遍、PLA2G4A、PLA2G4F蟆炊、PYCARD稽莉、RBCK1和TRAF5(圖10A、B)涩搓。
2污秆、在外部數(shù)據(jù)集GSE93606中進一步驗證了預(yù)后預(yù)測模型的效果。根據(jù)風(fēng)險評分將IPF患者分為高危組和低危組昧甘。在GSE93606中良拼，生存比較顯示低危組的預(yù)后明顯優(yōu)于高危組(圖10C)。
六充边、壞死性凋亡相關(guān)預(yù)后基因表達的初步驗證IPF A549細胞模型
1庸推、對以往肺纖維化單細胞測序數(shù)據(jù)集的分析表明常侦，壞死性凋亡與AT II密切相關(guān)。
2贬媒、qPCR結(jié)果顯示聋亡，CYLD、NLRP3际乘、IFNAR1和TRAF5在TGF-b處理組中高表達坡倔，而在對照組中低表達。CYLD和TRAF5在對照組和IPF組之間的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖11)脖含。
七罪塔、博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠模型預(yù)后基因表達的驗證
1、為了進一步驗證體外細胞實驗結(jié)果养葵，盡可能模擬肺纖維化患者的病理過程征堪，成功構(gòu)建了博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠模型進行體內(nèi)實驗。
2关拒、Western blot結(jié)果顯示佃蚜，壞死標(biāo)志物p-MLKL和4個與壞死相關(guān)的預(yù)后基因CYLD、NLRP3着绊、TRAF5爽锥、IFNAR1在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織中高表達(圖12A、B)畔柔。
3氯夷、HE和Masson染色結(jié)果顯示，與對照組相比靶擦，博來霉素組肺組織炎癥和膠原沉積明顯增加(圖12C)腮考。
總結(jié)：程序性壞死相關(guān)信號通路在IPF中大量富集。本文共篩選出29個NRDEGs玄捕，其中12個在GSE213001中表達趨勢一致踩蔚。Spearman相關(guān)性分析顯示，NRDEGs表達與促炎免疫細胞浸潤呈正相關(guān)枚粘，與抗炎免疫細胞浸潤呈負相關(guān)馅闽。包括MLKL在內(nèi)的NRDEGs在纖維化肺組織AT II中高表達。通過cox逐步回歸構(gòu)建4個NRDEG的壞死性凋亡相關(guān)預(yù)測模型馍迄。在驗證數(shù)據(jù)集GSE93606中福也，預(yù)后預(yù)測模型顯示出良好的適用性。程序性壞死在IPF中存在攀圈，并可能在ATII期發(fā)生暴凑。程序性壞死與免疫浸潤相關(guān)，提示ATII程序性壞死可能通過激活免疫浸潤和免疫應(yīng)答參與IPF的發(fā)生赘来。
