研究背景：
特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種尚未明確發(fā)表機制的肺病。近年來填硕，IPF的發(fā)病率隨時間增加麦萤。壞死性凋亡是一種促炎型的程序性細胞死亡，可促進細胞內容物的釋放以激活免疫反應廷支。近年來频鉴，免疫浸潤一直是癌癥研究領域的熱點。多種免疫細胞在肺纖維化過程中起重要作用恋拍。
關于非腫瘤生信垛孔，我們也解讀過很多，主要有以下類型
1 單個疾病WGCNA+PPI分析篩選hub基因施敢。
2 單個疾病結合免疫浸潤周荐，熱點基因集，機器學習算法等僵娃。
3 兩種相關疾病聯(lián)合分析概作，包括非腫瘤結合非腫瘤，非腫瘤結合腫瘤或者非腫瘤結合泛癌分析
4 基于分型的非腫瘤生信分析
5 單細胞結合普通轉錄組生信分析
目前非腫瘤生信發(fā)文的門檻較低默怨，有需要的朋友患者歡迎交流
流程圖：
研究結果：
一讯榕、IPF與對照間DEG和壞死性凋亡相關DEG（NRDEG）的鑒定
1、差異分析前對GSE110147中的IPF組和對照組進行主成分分析(PCA)匙睹，發(fā)現(xiàn)兩組之間具有明顯的可比性愚屁。
2、圖2A描繪了PCA的結果痕檬。隨后霎槐，通過差異分析發(fā)現(xiàn)GSE110147中IPF和對照組之間有3253個DEGs。
3梦谜、圖2B通過熱圖的可視化顯示了DEGs的表達丘跌。壞死性凋亡相關基因與GSE110147中的DEGs重疊袭景，進一步分析29個重疊的NRDEGs。
4闭树、圖2C以維恩圖顯示29個NRDEGs耸棒。
5、通過熱圖和火山圖來顯示NRDEGs的表達报辱，如圖2D, E榆纽。
二、PPI網(wǎng)絡及功能通路分析
1捏肢、從STRING數(shù)據(jù)庫構建NRDEGs的PPI網(wǎng)絡(圖3A)。
2饥侵、基于CytoHubba MCC的算法被用來識別前10個樞紐基因(圖3B)鸵赫，包括CFLAR、BIRC2躏升、BIRC3辩棒、CYLD、TRAF5膨疏、IL1B一睁、STAT1、INFAR1佃却、TICAM1和NLRP3者吁。
3、對NRDEGs進行GO和KEGG富集分析饲帅，確定其生物學功能和相關信號通路(圖4A复凳、B)。
4灶泵、在分子功能中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子受體超家族結合育八、參與凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性和細胞因子受體結合的富集(圖4C)。
5赦邻、KEGG分析顯示髓棋，NRDEGs富集于壞死性凋亡NOD樣受體信號通路、TNF信號通路惶洲、甲型流感按声、新型冠狀病毒肺炎、單純皰疹病毒1型感染湃鹊、脂質和動脈粥樣硬化儒喊、C型凝集素受體信號通路、丙型肝炎(圖4D)币呵。
三怀愧、免疫浸潤及NRDEGs與免疫細胞的相關性
1侨颈、通過富集分析，觀察到NRDEGs主要與免疫相關信號通路相關芯义。
2哈垢、利用ImmuCellAI算法研究了IPF中程序性壞死和免疫浸潤之間的關系。結果顯示IPF組和對照組之間有12種免疫細胞類型存在顯著差異(圖5A-D)扛拨。
3耘分、spearman相關性檢驗結果顯示，NRDEGs主要與巨噬細胞和中性粒細胞浸潤呈正相關绑警，與DC細胞和NK細胞浸潤呈負相關求泰，通過相關熱圖可以直觀顯示(圖5E)。
四计盒、研究NRDEGs在肺纖維II型肺泡上皮細胞中的表達
1渴频、為了進一步探索IPF中程序性壞死與細胞類型的關系，提取了GSE122960的單細胞測序數(shù)據(jù)進行分析北启。
2卜朗、在AT II中觀察到4831個差異表達基因。篩選出31個重疊的NRDEGs咕村，包括MLKL场钉、IFNAR1和TRAF5。圖6A顯示了維恩圖可視化中的31個NRDEGs懈涛。
3逛万、通過火山圖觀察NRDEGs的表達情況，如圖6B所示批钠。
四泣港、預后相關樞紐基因的鑒定及預后預測模型
1、GSE70866包含176例IPF患者的測序數(shù)據(jù)价匠，sva包消除了批次效應当纱。去除效果以PCA圖表示(圖7A, B)。
2踩窖、提取樞紐基因和預后數(shù)據(jù)的表達矩陣坡氯，KM曲線顯示單因素Cox回歸分析得到的生存差異基因(圖7C-F)。
3洋腮、多因素cox回歸顯示IFNAR1箫柳、TRAF5、NLRP3啥供、CYLD與預后相關悯恍。結果以森林圖的形式顯示(圖8)。作者基于多因素cox回歸的結果構建了預后模型
4伙狐、預后模型分析顯示涮毫，與低危組相比瞬欧，高危組的預后明顯更差(圖9A)。
5罢防、該生存評估模型對IPF患者預后具有較好的預測價值艘虎，AUC為0.708(圖9B)。
6咒吐、本研究還基于Cox模型建立了總生存預測列線圖(圖9C)野建。
五、NRDEGs表達及預后預測模型效果的驗證
1恬叹、通過對GSE213001的分析候生，共發(fā)現(xiàn)27個相同的NRDEGs。27個NRDEGs中有12個基因的表達趨勢與GSE110147一致绽昼，包括BIRC2陶舞、BIRC3、CYLD绪励、DNM1L、HSP90AA1唠粥、IL1B疏魏、NLRP3、PLA2G4A晤愧、PLA2G4F大莫、PYCARD、RBCK1和TRAF5(圖10A官份、B)只厘。
2、在外部數(shù)據(jù)集GSE93606中進一步驗證了預后預測模型的效果舅巷。根據(jù)風險評分將IPF患者分為高危組和低危組羔味。在GSE93606中，生存比較顯示低危組的預后明顯優(yōu)于高危組(圖10C)钠右。
六赋元、壞死性凋亡相關預后基因表達的初步驗證IPF A549細胞模型
1、對以往肺纖維化單細胞測序數(shù)據(jù)集的分析表明飒房，壞死性凋亡與AT II密切相關搁凸。
2、qPCR結果顯示狠毯，CYLD护糖、NLRP3、IFNAR1和TRAF5在TGF-b處理組中高表達嚼松，而在對照組中低表達嫡良。CYLD和TRAF5在對照組和IPF組之間的表達差異有統(tǒng)計學意義(圖11)锰扶。
七、博萊霉素誘導肺纖維化小鼠模型預后基因表達的驗證
1皆刺、為了進一步驗證體外細胞實驗結果少辣，盡可能模擬肺纖維化患者的病理過程，成功構建了博萊霉素誘導肺纖維化小鼠模型進行體內實驗羡蛾。
2漓帅、Western blot結果顯示，壞死標志物p-MLKL和4個與壞死相關的預后基因CYLD痴怨、NLRP3忙干、TRAF5、IFNAR1在博來霉素誘導的小鼠肺組織中高表達(圖12A浪藻、B)捐迫。
3、HE和Masson染色結果顯示爱葵，與對照組相比施戴，博來霉素組肺組織炎癥和膠原沉積明顯增加(圖12C)。
總結：
程序性壞死相關信號通路在IPF中大量富集萌丈。本文共篩選出29個NRDEGs赞哗，其中12個在GSE213001中表達趨勢一致。Spearman相關性分析顯示辆雾，NRDEGs表達與促炎免疫細胞浸潤呈正相關肪笋，與抗炎免疫細胞浸潤呈負相關。包括MLKL在內的NRDEGs在纖維化肺組織AT II中高表達度迂。通過cox逐步回歸構建4個NRDEG的壞死性凋亡相關預測模型藤乙。在驗證數(shù)據(jù)集GSE93606中，預后預測模型顯示出良好的適用性惭墓。程序性壞死在IPF中存在坛梁，并可能在ATII期發(fā)生。程序性壞死與免疫浸潤相關腊凶，提示ATII程序性壞死可能通過激活免疫浸潤和免疫應答參與IPF的發(fā)生罚勾。
