轉(zhuǎn)發(fā)自http://crickcollege.com/news/172.html
寫在前面
從10月底開(kāi)始趣惠，由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂正式開(kāi)班了！整個(gè)課程由21堂大課組成。作為蛋白質(zhì)組學(xué)純小白一枚，小編也打算借這個(gè)機(jī)會(huì)好好學(xué)習(xí)感受一下。繼第一講“蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述”以后舔琅，小編繼續(xù)整理了第二講“蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)樣品前處理”的聽(tīng)課筆記，分享給各位沙绝。
授課老師
這次課程的授課老師是來(lái)自復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院的劉曉慧博士搏明。復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院楊芃原老師實(shí)驗(yàn)室是中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域綜合實(shí)力最強(qiáng)的團(tuán)隊(duì)之一，劉曉慧老師就是在這里獲得了她的化學(xué)生物學(xué)博士學(xué)位闪檬，并在楊老師實(shí)驗(yàn)室工作十余年星著。作為實(shí)驗(yàn)室的骨干力量，她擁有非常豐富的蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)技能與經(jīng)驗(yàn)粗悯，并從事基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)和多肽定量方法的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)虚循，精通iTRAQ、MRM样傍、MRM-HR横缔、SWATH等相關(guān)技術(shù)，參與發(fā)表相關(guān)論文30余篇衫哥。劉老師在授課中詳細(xì)分享了她在蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)樣品前處理方面多年積累的珍貴經(jīng)驗(yàn)與心得茎刚，這樣的學(xué)習(xí)機(jī)會(huì)實(shí)屬難得！
（文中所有圖片均來(lái)自劉曉慧博士的講義撤逢，并獲得發(fā)表授權(quán)膛锭。）
這節(jié)課呢，劉老師講了三個(gè)部分的內(nèi)容：
--樣品前處理需要達(dá)到的目的
--不同類型的樣品提取方法及進(jìn)展介紹
--不同預(yù)分級(jí)策略介紹
雖說(shuō)第三部分“不同預(yù)分級(jí)策略介紹”應(yīng)該是屬于LC-MS那部分的前處理步驟蚊荣，劉老師也選擇在這節(jié)課上一起介紹了初狰。那么，請(qǐng)大伙兒跟著小編互例，一起來(lái)梳理一下這節(jié)課的內(nèi)容精華吧奢入！
樣品前處理目的
首先，我們來(lái)問(wèn)一個(gè)問(wèn)題：為什么要進(jìn)行樣品的前處理？
上面的圖描述了整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)的分析流程：咱們先從組織、體液或細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，拿到蛋白混合溶液（根據(jù)你的研究目的，可以對(duì)蛋白先做分離剂陡，或者不分離），接下來(lái)還原烷基化（還原的過(guò)程是將蛋白的二硫鍵打開(kāi)，然后烷基化可以修飾巰基，防止游離的巰基再生成二硫鍵）處理，并酶解成肽段聋伦。紅線以上都屬于樣品的制備階段夫偶。
既然蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的目的界睁，是為了盡可能準(zhǔn)確地對(duì)盡可能多的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，那么兵拢，順理成章的翻斟，我們?yōu)槭裁匆鲞@些復(fù)雜的前處理呢，就是要減少在實(shí)驗(yàn)階段對(duì)蛋白的人為降解和修飾说铃，釋放盡可能多的肽段访惜，送進(jìn)質(zhì)譜來(lái)檢測(cè)，對(duì)吧腻扇？
為了更好地聊這個(gè)問(wèn)題债热，我們先來(lái)復(fù)習(xí)一下如何利用質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)，以此來(lái)反推前期樣品處理需要達(dá)到怎樣的目的幼苛。
拿到處理好的蛋白樣品以后窒篱，我們先將樣品酶解成肽段，得到一級(jí)譜圖舶沿，再由肽段離子與惰性氣體碰撞生成碎片離子墙杯，得到二級(jí)譜圖。然后我們用實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖進(jìn)行匹配括荡，從而判斷肽段的氨基酸組成高镐，然后再根據(jù)肽段反推出蛋白質(zhì)。
上圖的最下面是是數(shù)據(jù)庫(kù)里搜索的序列畸冲，綠色部分是置信度在95%以上的肽段嫉髓，紅色是置信度在50%以上的肽段≌偌校基于這些置信度比較高的肽段岩喷，我們才能推斷出這個(gè)蛋白存在于樣品中。所以监憎，對(duì)于每個(gè)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)纱意，根據(jù)實(shí)驗(yàn)譜圖匹配到的肽段越多，對(duì)于這個(gè)蛋白的鑒定結(jié)果就越可信鲸阔。
那么偷霉，樣品預(yù)處理時(shí)，首要目的就是避免隨機(jī)降解褐筛，才能得到用特定蛋白酶特異性剪切得到的肽段类少，拿這些肽段生成的實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖比對(duì)，才能得到可靠的比對(duì)結(jié)果渔扎。否則硫狞，蛋白的隨機(jī)斷裂位點(diǎn)與特異性酶切位點(diǎn)根本對(duì)不上，那拿到的實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖完全就是兩回事，最后的結(jié)果就是残吩，要么檢測(cè)不到蛋白财忽，要么檢測(cè)到的都是錯(cuò)的。
樣品的收集與保存
樣本預(yù)處理之前泣侮，我們需要先收集和保存樣品即彪。這一步可不能馬虎，如果收集的方法或者保存的方式不得當(dāng)活尊，就會(huì)嚴(yán)重影響后面的預(yù)處理步驟以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果隶校！以下三類樣品的收集與保存尤其需要留意：
--組織樣品：1)對(duì)于人體手術(shù)切除的組織，有條件的話蛹锰，最好用PBS（磷酸緩沖鹽溶液深胳，作為溶劑，起溶解保護(hù)試劑的作用）取完之后直接去血宁仔。如果沒(méi)有去血稠屠，可以-80℃液氮保存，干冰運(yùn)輸翎苫。
2）對(duì)于小鼠权埠、大鼠、兔子之類的組織樣品煎谍，建議用灌流的方式來(lái)去血攘蔽，尤其是像肝臟、胃呐粘、心臟這類大的組織满俗，可以直接用灌流的方式去血，去得最干凈作岖。其次的方案是在后期剪碎的時(shí)候去血唆垃。
話說(shuō)，這里為什么要強(qiáng)調(diào)去血呢痘儡？因?yàn)檠褐杏惺畮追N含量特別高的高豐度蛋白質(zhì)辕万，占了血液蛋白總量的95%，如果你的研究目標(biāo)并不包括血液蛋白沉删，而這部分蛋白又存在于樣品中渐尿，那就悲劇了。大家回憶一下矾瑰，我們第一節(jié)課的聽(tīng)課筆記中專門提到的數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）砖茸，當(dāng)樣品中有大量高豐度蛋白的時(shí)候，來(lái)自中低豐度蛋白的肽段信號(hào)就會(huì)被大大抑制殴穴，連進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜的機(jī)會(huì)都會(huì)變得很渺茫凉夯，還怎么愉快地檢測(cè)货葬？
--細(xì)胞樣品：常規(guī)實(shí)驗(yàn)，建議收到5*1E61E7個(gè)細(xì)胞以上的樣品量（有些實(shí)驗(yàn)需要的樣品量會(huì)少一些劲够，后面會(huì)詳細(xì)講）宝惰。細(xì)胞取好后，首先用PBS清洗一下細(xì)胞表面再沧，因?yàn)榇蟛糠峙囵B(yǎng)基里面都含有血清，這部分血清得洗干凈了先
如果是做分泌蛋白研究的話尊残，首先用PBS清洗樣品幾次炒瘸，再用條件培養(yǎng)基（不含有血清的培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞情況寝衫，大概12個(gè)小時(shí)以后顷扩，離心，去掉細(xì)胞碎片慰毅，取上清隘截，就能提取到分泌蛋白了。
--血清樣品：1）血漿樣品：可以通過(guò)醫(yī)院常用的EDTA抗凝管進(jìn)行收集汹胃，收集到的血漿會(huì)呈懸浮狀態(tài)婶芭，離心去掉血細(xì)胞。
2）血清樣品：現(xiàn)在大部分研究都直接針對(duì)血清樣品着饥，它的成份更簡(jiǎn)單犀农，沒(méi)有凝集素，沒(méi)有大量的血細(xì)胞宰掉，針對(duì)性會(huì)更強(qiáng)呵哨。收集血清樣品時(shí)，直接把血清吸到管子里轨奄，室溫靜置讓它凝結(jié)孟害，上清黃色部分就是血清樣品啦。
好挪拟，我們收集好樣品后挨务，接下來(lái)就開(kāi)始做樣品前處理了。它分幾步走呢舞丛？看下圖：
后面會(huì)詳細(xì)聊每一步耘子，這里我們先做點(diǎn)兒背景鋪墊，大伙兒心里先有個(gè)譜：
鋪墊之一：第二步“充分溶解蛋白”尤為重要球切，如果蛋白沒(méi)有充分溶解谷誓，能提取到的蛋白就會(huì)很少，達(dá)不到研究目的吨凑。
鋪墊之二：在第一捍歪、二步户辱，即破碎樣品和溶解樣品的過(guò)程中，為了減少人為操作引入的修飾糙臼，通常會(huì)準(zhǔn)備大量的冰庐镐，進(jìn)行冰上的操作。同時(shí)還需要加入蛋白酶抑制劑变逃，防止在操作過(guò)程中蛋白被樣品中自帶的蛋白酶降解掉必逆。
說(shuō)到樣品中自帶的蛋白酶，尤其要高度重視的是胰腺樣品揽乱，如果你在室溫下解凍名眉，整個(gè)樣品可以直接化成水。胰腺本身含有非常豐富的胰蛋白酶凰棉，在體外的室溫環(huán)境下损拢，胰蛋白酶的活性沒(méi)有誰(shuí)來(lái)抑制它，于是可以完全釋放天性撒犀，把組織樣品里的蛋白都分解掉了福压！所以針對(duì)胰腺樣品，要非常小心或舞，必須在冰上操作荆姆，利用低溫環(huán)境控制蛋白酶的活性。
鋪墊之三：關(guān)于第三步“解旋蛋白質(zhì)”映凳。通常胞枕，蛋白質(zhì)都是成球狀的穩(wěn)定狀態(tài)，解旋蛋白質(zhì)就是將球狀蛋白中的二硫鍵打開(kāi)魏宽，讓它形成鏈狀結(jié)構(gòu)腐泻，以便進(jìn)行下一步酶切。以下圖胰島素結(jié)構(gòu)圖為例队询，胰島素分子通過(guò)很多二硫鍵形成穩(wěn)定的球狀結(jié)構(gòu)派桩，親水基團(tuán)主要集中在表面，而疏水基因都包裹在里面蚌斩，如果用特異性酶直接作用于這些球狀蛋白铆惑，包裹在里面的序列就不容易被酶作用到，酶切的效率就會(huì)很低~
如果能將這些二硫鍵打開(kāi)送膳，球狀結(jié)構(gòu)被破壞员魏，蛋白分子就會(huì)變成鏈狀，酶切位點(diǎn)才能盡可能多地暴露在酶環(huán)境里叠聋，這時(shí)候我們?cè)偌尤胩禺愋悦杆貉郑湍艿玫礁嗟拿附怆亩巍?/p>
鋪墊之四：對(duì)于第五步去除雜質(zhì)，其實(shí)伴隨著整個(gè)預(yù)處理的過(guò)程碌补。雜質(zhì)都是從哪里來(lái)的呢虏束？比如棉饶，從組織中帶來(lái)的雜質(zhì)，提取溶液镇匀、酶解樣品中帶來(lái)的鹽等照藻。我們要知道，質(zhì)譜是一個(gè)非常靈敏的儀器汗侵，它檢測(cè)的是多肽的質(zhì)荷比幸缕。所有的鹽類，以及所有會(huì)進(jìn)行離子化的雜質(zhì)晰韵，都會(huì)干擾到肽段的檢測(cè)冀值。所以我們會(huì)要求進(jìn)入質(zhì)譜之前的蛋白樣品非常干凈。在蛋白水平及肽段水平都會(huì)進(jìn)行去除雜質(zhì)的步驟宫屠。
樣品的破碎
好，接下來(lái)我們就從破碎樣本開(kāi)始滑蚯，詳細(xì)聊聊每一步具體應(yīng)該怎么做浪蹂，需要用到哪些方法、工具和試劑告材，以及操作的技巧和需要注意的那些小細(xì)節(jié)坤次。
第一步 破碎樣品
樣品破碎的方法主要分三類：
1、機(jī)械碎裂：簡(jiǎn)單粗暴斥赋，把組織研 碎缰猴，比如骨骼組織，強(qiáng)體力活疤剑！
1）液氮研磨：適用于大部分組織樣品滑绒，比如常見(jiàn)的胃臟樣品、腸樣品隘膘、肝臟樣品等疑故。把所有的器皿、研缽弯菊，以及樣品纵势，都放到-80℃環(huán)境下，然后把樣品放到研缽里管钳，倒入液氨钦铁，整個(gè)樣品會(huì)凍得非常脆，然后就大力研磨才漆，直到磨成粉末牛曹；
2）勻漿：適用于亞細(xì)胞器的破碎，使用Dunce勻漿器醇滥。注意哈躏仇，勻漿沒(méi)有液氨研磨那么劇烈恋脚，除亞細(xì)胞器以外的蛋白提取，通常還是建議用液氨研磨焰手，破碎得更充分一些糟描。
3） 搗碎法：用研磨的方法破碎樣品，如果樣品量又大书妻，那可是件非常辛苦的事情船响！于是一些公司推出了細(xì)胞破碎儀，利用玻璃珠或者磁珠劇烈地震蕩躲履，或者用刀片高速旋轉(zhuǎn)见间，總之，用電力代表人力工猜，幫助我們做樣品破碎米诉。
2、物理破碎：靠足夠大的溫差篷帅、壓力差等方法史侣，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂
1）溫差法：通常用于含有細(xì)胞壁的樣品，比如一些細(xì)菌樣品魏身，利用高溫和低溫的反復(fù)變化惊橱，破壞細(xì)胞壁。
2）壓力差法：適用于組織樣品箭昵，通過(guò)高壓和低壓的反復(fù)變化税朴，實(shí)現(xiàn)對(duì)組織樣品的破碎，
3）超聲破碎法：適用于細(xì)胞層次的樣品
3家制、化學(xué)處理法：使用各種水解酶正林、變性劑或表面活性劑等，破碎細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)颤殴，導(dǎo)致細(xì)胞的破碎卓囚。
事實(shí)操作中呢，我們通常會(huì)將幾種方法結(jié)合起來(lái)使用诅病。比如先液氨研磨哪亿，拿去提取蛋白，檢測(cè)一下蛋白含量贤笆，發(fā)現(xiàn)破碎不夠充分蝇棉，于是又再用超聲的方法，或者結(jié)合比較強(qiáng)的變性劑的方法等等芥永，增強(qiáng)樣品破碎的程度篡殷，釋放更多的蛋白。
說(shuō)到化學(xué)處理法埋涧，我們來(lái)看看樣品前處理中會(huì)用到哪些抽提試劑吧板辽。
上面列出的一些重要的試劑奇瘦，我們來(lái)詳扒一下：
1） 8M尿素：這是比較強(qiáng)的變性劑，有時(shí)也會(huì)用6M尿素劲弦。
需要注意的是耳标，在加入8M尿素以后，所有處理過(guò)程不能超過(guò)37℃邑跪，否則會(huì)將蛋白質(zhì)的氨基胍基化次坡，影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，影響后續(xù)的酶解画畅，以及質(zhì)譜檢測(cè)砸琅，后果很嚴(yán)重！另外轴踱，如果這一步你用了8M尿素症脂，后面又要用胰酶來(lái)做酶解，那么加入胰酶之前淫僻，一定要先將尿素稀釋到1M诱篷，否則高濃度的尿素會(huì)讓胰酶也變性，失去活性嘁傀。
2） 硫脲：能起到助溶的效果，也是一種還原劑视粮，它的還原性與一些試劑盒是不兼容的细办，比如BCA試劑盒。
Tips: 處理過(guò)程中,我們要注意每一步的溶劑是否與下一步的溶劑兼容（兼容的意思就是蕾殴，能不能一起使用）笑撞。根據(jù)它們的兼容性來(lái)進(jìn)行選擇。
3） 4%SDS：很強(qiáng)的去污劑钓觉，但與胰酶不兼容茴肥，并且很難通過(guò)超濾的方法脫去的，它在超濾脫鹽的過(guò)程中仍保留在蛋白樣品中間荡灾。對(duì)于這類去污劑瓤狐，我們通常會(huì)利用有機(jī)溶劑來(lái)去除它們，比如丙酮沉淀批幌。
Note: 這些去污劑础锐，在樣品進(jìn)入質(zhì)譜前都要去除干凈，否則它們會(huì)在質(zhì)譜的電場(chǎng)下離子化荧缘，影響我們的分析皆警。因此呢，去污劑要慎用截粗！
4） 還原劑：功能是打開(kāi)二硫鍵信姓，使蛋白分子盡量從球狀變成鏈狀鸵隧，增加蛋白質(zhì)的溶解性，以及暴露出盡可能多的酶切位點(diǎn)意推。
5） 蛋白酶抑制劑：夏天尤其需要豆瘫，當(dāng)溫度比較高的時(shí)候，酶的活性也會(huì)較高左痢，蛋白樣品很容易發(fā)生自降解靡羡。如果做特殊樣品的處理，比如磷酸化樣品或其它翻譯后修飾樣品的富集俊性，要針對(duì)性地加入這一類酶的抑制劑略步。
6） 有機(jī)試劑：用來(lái)沉淀蛋白質(zhì)，去除雜質(zhì)定页。比如前面提到的去污劑趟薄，我們就可以利用有機(jī)試劑來(lái)去除它們；另外典徊，針對(duì)植物樣品或昆蟲樣品杭煎，樣品本身含有很多色素，比如葉綠素卒落，昆蟲翅膀上的色素等羡铲，也可以用有機(jī)試劑將色素溶解掉，然后進(jìn)行洗滌儡毕。
特別注意：整個(gè)處理過(guò)程中也切，所有使用的EP管、槍頭腰湾、裝試劑的塑料瓶雷恃，都盡量用進(jìn)口的產(chǎn)品，尤其是當(dāng)使用到強(qiáng)溶解性的溶液费坊！國(guó)產(chǎn)的EP管上的材料（聚乙二醇）很容易被這些溶液洗脫下來(lái)倒槐，進(jìn)入樣品中，并且很難洗脫掉附井。而聚乙二醇非常容易離子化讨越，會(huì)在質(zhì)譜里形成很強(qiáng)的塑料峰，甚至?xí)耆谏w目標(biāo)肽段的峰永毅，造成檢測(cè)的失敾蚜 ！
劉老師講課的內(nèi)容卷雕，小編今天先分享到這里节猿，下次我們繼續(xù)聊針對(duì)不同樣品的蛋白提取方法、提取完的質(zhì)量控制等部分，敬請(qǐng)期待哦滨嘱！
