1.引物是DNA還是RNA?
引物是在DNA分子復(fù)制時(shí)期引導(dǎo)作用的一段短RNA或單鏈DNA片段寺擂，可結(jié)合在脫氧核苷酸鏈上與之互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域浇坐，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)诅诱，DNA聚合酶可由其3‘端開(kāi)始合成新的核酸鏈壹置。
細(xì)胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過(guò)程：雙鏈的解開(kāi)→RNA引物的合成→DNA鏈的延伸→切除RNA引物孕似，填補(bǔ)缺口并連接相鄰的DNA片段踩娘。
在細(xì)胞中只有RNA聚合酶可以從頭合成RNA，而DNA聚合酶由于它的保真系統(tǒng)決定它不能從頭合成DNA單鏈喉祭。
在PCR儀中用的時(shí)DNA引物养渴，是人工設(shè)計(jì)合成的，引物不會(huì)在PCR儀中復(fù)制泛烙，而是設(shè)計(jì)并配比好加入體系的理卑。為什么不用RNA作為引物，因?yàn)镽NA引物需要被切除蔽氨，而PCR儀中沒(méi)有這種酶藐唠，再說(shuō)，若用的RNA引物被酶切除后將使這個(gè)新合成的DNA的兩端都出現(xiàn)一段單鏈不穩(wěn)定的DNA.
每一次都會(huì)有加長(zhǎng)的單鏈產(chǎn)生鹉究，但其數(shù)目增長(zhǎng)遠(yuǎn)小于目的片段宇立，可忽略不計(jì)。
2.融合PCR
融合PCR技術(shù)（fusion PCR）采用具有互補(bǔ)末端的引物自赔，形成具有重疊鏈的PCR產(chǎn)物妈嘹，通過(guò)PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸，從而將不同來(lái)源的任意DNA片段連接起來(lái)绍妨，此技術(shù)在不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理的條件下實(shí)現(xiàn)DNA片段的體外連接润脸，為同源重組片段的構(gòu)建提供了快速簡(jiǎn)捷的途徑。
需要將A片段的下游引物含有B片段的一部分他去，B片段的上游引物含有A片段的一部分毙驯，這樣分別擴(kuò)增獲得A和B就含有了互補(bǔ)片段。
如圖中第一步中的P2含有一部分B片段序列灾测，P3含有A片段一部分序列
參考：融合PCR的PPT介紹
注意事項(xiàng)：融合 PCR 實(shí)驗(yàn)-融合 PCR 實(shí)驗(yàn)-丁香實(shí)驗(yàn) (biomart.cn)
3.臨界溫度退火PCR
退火溫度與時(shí)間爆价，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度行施，還有靶基序列的長(zhǎng)度允坚。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物蛾号，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想稠项。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值（解鏈溫度，50%雙鏈打開(kāi)時(shí)的溫度）=4（G+C）+2（A+T）
復(fù)性溫度=Tm值 -（5～10℃）退火溫度（Annealing Temperature） 是指引物和模板結(jié)合時(shí)候的溫度參數(shù)鲜结，當(dāng)50%的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度展运。
在Tm值允許范圍內(nèi)活逆，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性拗胜。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec蔗候，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。
4.Touch down PCR
一般簡(jiǎn)并引物使用的較多埂软。
設(shè)計(jì)多循環(huán)反應(yīng)的程序锈遥，以使相連循環(huán)的退火溫度越來(lái)越低。由于開(kāi)始時(shí)的退火溫度選擇為高于估計(jì)的Tm值勘畔，隨著循環(huán)的進(jìn)行所灸，退火溫度逐漸降到Tm值，并最終低于這個(gè)水平炫七，用于確保第一個(gè)引物—模板雜交事件發(fā)生在最互補(bǔ)的反應(yīng)物之間爬立，即那些產(chǎn)生目的擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)物之間。盡管退火溫度最終會(huì)降到非特異雜交的Tm值万哪，但此時(shí)目的擴(kuò)增產(chǎn)物已開(kāi)始幾何擴(kuò)增侠驯，在剩下的循環(huán)中處于超過(guò)任何滯后（非特異）PCR產(chǎn)物的地位。
由于目標(biāo)是在較早的循環(huán)中避免低Tm值配對(duì)奕巍，在TD—PCR中最好應(yīng)用熱啟動(dòng)技術(shù)吟策。設(shè)計(jì)時(shí)，退火溫度的范圍應(yīng)跨越15℃左右伍绳，從高于估計(jì)Tm值至少幾度到低于它10℃踊挠。
例：一對(duì)沒(méi)有簡(jiǎn)并的引物—模板的計(jì)算Tm值為62℃乍桂。
則：從65℃—>50℃（每2cycles降退火溫度1℃）冲杀，再在50℃退火溫度下做15個(gè)循環(huán)。
實(shí)驗(yàn)中如持續(xù)出現(xiàn)假象帶（雜帶）睹酌，則是因?yàn)槠鹗纪嘶饻囟忍腿ㄋ蚰康臄U(kuò)增產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物的Tm值相差無(wú)幾，或非目的擴(kuò)增物以更高的擴(kuò)增效率擴(kuò)增憋沿，可把退火溫度每降低1℃所需的循環(huán)數(shù)增加到3或4旺芽。
