PCR

PCR是很多科研者進入實驗室做的第一個分子實驗报强，名字聽起來很高級，其實操作起來流程還是比較清晰明了拱燃，容易上手秉溉。聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction），簡稱PCR碗誉，用于放大特定的DNA片段召嘶，也可看作生物體外的特殊DNA復制。其中使用的Taq酶是1976年從溫泉中的細菌分離出來的哮缺。它的特性在于能耐高溫苍蔬，是一個很理想的酶。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復復制蝴蜓，而后隨著Mullis提出新的應用碟绑，PCR技術在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學獎茎匠。

PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程格仲，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后诵冒，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離凯肋，使之成為單鏈，以便它與引物結合汽馋，為下輪反應作準備侮东；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后圈盔，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合悄雅；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下驱敲，以dNTP為反應原料，靶序列為模板宽闲，按堿基互補配對與半保留復制原理众眨，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”容诬，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板娩梨。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍览徒。

?RT-PCR

逆轉錄-聚合酶鏈反應大概是我們接觸到的第二個PCR技術狈定。原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板习蓬，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA掸冤。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達友雳。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級稿湿，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產(chǎn)物押赊、獲取目的基因饺藤、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統(tǒng)流礁。

相對PCR來說涕俗，這個實驗主要是增加了模板的獲取過程。操作SOP按照說明書即可神帅。

這個實驗需要的注意事項：

1. 在實驗過程中要防止RNA的降解再姑，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中找御，注意避免mRNA的斷裂元镀。

2. 為了防止非特異性擴增，需要設陰性對照霎桅。

3. 內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量栖疑。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等滔驶。其目的在于避免RNA定量誤差遇革、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4. PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度萝快、序列锻霎、二級結構以及目標DNA起始的數(shù)量有關。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù)揪漩，均應通過單獨實驗來確定旋恼。

5. 防止DNA的污染：①采用DNA酶處理RNA樣品；②在可能的情況下氢拥，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性锨侯。

qRT-PCR

實時熒光定量（qRT-PCR）則可能是我們接觸的第三個PCR實驗对竣。無論是剛進實驗室的新手還是已經(jīng)操作多年的老手雏门，都時不時需要用這個技術來進行基因表達情況測定、轉基因的檢測、突變體基因的鑒定缚陷、組織差異性表達等。對于熟練的師兄師姐游昼，可能帶著耳機仪缸，在有節(jié)奏的槍頭吸打聲中就做出了完美的曲線。但是大部分第一次做這個實驗的人痴荐，面對的可能是滿屏黃標血柳，而且并不清楚這些值代表什么，為什么會有這樣的結果生兆。

實際上难捌，在做qRT-PCR之前，我們第一個需要確定的是內參基因鸦难，根據(jù)自己實驗材料和檢測的基因選擇好適合的內參基因后根吁。開始為自己的片段設計引物。

與目的基因在內的所有引物Tm值不應相差兩度合蔽。擴增片段的長度以200-300

bp為宜击敌。除此之外，還需要注意以下法則：1）用于突變體的基因表達量鑒定時拴事，引物最好設在兩個外顯子之間沃斤，橫跨中間的內含子，這樣可以避免DNA的污染刃宵；2）用于過表達基因表達量時轰枝，需找出該家族所有同源基因并進行比對，并在保守性最差的區(qū)域設計引物组去；3）用于標記基因檢測的引物序列最好來自發(fā)表的文獻鞍陨。

最后值得注意的是，引物用完后需放入-20℃保存。盡量避免反復凍融诚撵，如果多次使用可在第一次溶解好后進行分裝缭裆。如果在實驗過程中出現(xiàn)以前能擴增的基因擴不出的現(xiàn)象，多半是引物降解或部分降解導致的寿烟。在實驗期間引物解凍后需用渦旋混勻澈驼，離心待用。

最后附一些實用的qRT-PCR體系配置技巧：

1）一定要在冰上配置體系筛武；

2）所有的槍頭和PCR板都用進口的缝其，滅菌的；

3）盡量用同一槍頭完成樣品分裝徘六，并且把控每次按壓槍的位置標準内边；

4）模版加在管壁上，避免槍頭離開時抽吸液體待锈，最后離心漠其。

腫瘤中激活的T細胞，控制腫瘤生長等竿音，期待這些研究的臨床試驗數(shù)據(jù)和應用和屎。