引言

mRNA 3’末端加工是基因表達(dá)中必不可少的一步。經(jīng)典的真核生物前體mRNA 3’加工是在由數(shù)十種反式作用蛋白組成的大分子機(jī)器內(nèi)進(jìn)行的冒黑。然而级乐，RNA在這個(gè)過程中是否起作用目前還不清楚撕瞧。本文作者發(fā)現(xiàn)小核仁RNA（snoRNA）的一個(gè)新功能罐孝，即在mRNA 3’加工過程中起作用呐馆。

摘要：mRNA 3’末端加工是基因表達(dá)中必不可少的一步。經(jīng)典的真核生物前體mRNA 3’加工是在由數(shù)十種反式作用蛋白組成的大分子機(jī)器內(nèi)進(jìn)行的莲兢。然而汹来，RNA在這個(gè)過程中是否起作用目前還不清楚。本文作者發(fā)現(xiàn)小核仁RNA（snoRNA）的一個(gè)子集與哺乳動(dòng)物mRNA 3’加工相關(guān)改艇。這些snoRNA主要與Fip1（裂解和聚腺苷酸化特異性因子（CPSF）的一個(gè)組分）相互作用收班。作者對(duì)這些snoRNA中的一種進(jìn)行了功能性鑒定，研究結(jié)果表明谒兄，U/A豐富的SNORD50A通過阻斷Fip1-poly（A）位點(diǎn)（PAS）的相互作用抑制mRNA3’末端的加工摔桦。SNORD50A消耗改變了Fip1-RNA相互作用的格局并且改變了可變聚腺苷酸化（APA）概況。

本文揭示了snoRNA的一種新功能承疲，并提供了第一個(gè)證據(jù)邻耕，即非編碼RNAs可能在調(diào)控mRNA 3’末端的加工中發(fā)揮重要作用。

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1纪隙、SnoRNA的一個(gè)子集與mRNA 3’末端加工的復(fù)合體有結(jié)合

本文作者使用一種常用的用于體外mRNA 3’端加工測(cè)定的PAS RNA底物(SVL) PAS做為mRNA研究對(duì)象赊豌。作者首先用(SVL) PAS作為探針進(jìn)行RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，(SVL) PAS的點(diǎn)突變探針作為陰性對(duì)照绵咱，獲得了與之結(jié)合的蛋白及RNA。將獲得結(jié)合的RNA進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)一些特異的snoRNA被富集下來

然后作者將pull-down的產(chǎn)物RNA進(jìn)行northern blot驗(yàn)證證明了測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性（下圖C）熙兔，表明了四種snoRNA（SNORD50A悲伶、SNORA5A、SNORD102住涉、SNORD22）與(SVL) PAS的關(guān)聯(lián)性麸锉；另外，作者將pull-down獲得的蛋白進(jìn)行WB檢測(cè)已知的3’末端加工因子Wdr33, CPSF30, CPSF160,CstF64, CstF64發(fā)現(xiàn)它們與(SVL) PAS具有關(guān)聯(lián)性（下圖B）舆声。

已知snoRNA與幾種特異性蛋白質(zhì)配體組裝成經(jīng)典的RNP花沉，于是作者又將pull-down獲得的蛋白進(jìn)行WB檢測(cè)組成RNP的核心蛋白如dyskerin, NOP58和fbrillarin發(fā)現(xiàn)它們與(SVL) PAS不具有相關(guān)性（下圖B）柳爽。說明包含有snoRNA的Mrna 3’末端加工復(fù)合體并沒有形成經(jīng)典的RNP。

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2碱屁、SNORD50A調(diào)節(jié)mRNA 的3’末端加工

上面的結(jié)果說明了一些snoRNA是mRNA 3’端加工復(fù)合體的組成部分磷脯，那么這些復(fù)合體中的snoRNA是否對(duì)mRNA的3’端加工其作用呢？作者將復(fù)合體中富集最多的SNORD50A作為研究的焦點(diǎn)娩脾。

作者首先通過體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SNORD50A對(duì)SVL PAS的3’端加工的影響赵誓，以不在復(fù)合體中富集的SNORA78作為陰性對(duì)照，結(jié)果表明隨著SNORD50A的增加SVL PAS的poly(A)形成減少（下圖A）柿赊。說明SNORD50A能在體外抑制SVL PAS的3’端加工俩功。

后作者在細(xì)胞體內(nèi)對(duì)SNORD50A進(jìn)行過表達(dá)和敲低處理后檢測(cè)SVL PAS的活性，結(jié)果表明SNORD50A過表達(dá)后SVL PAS的活性明顯降低（下圖B）碰声，而敲低后SVLPAS的活性明顯升高诡蜓。說明SNORD50A能在體內(nèi)抑制SVLPAS的3’端加工（下圖C、D）胰挑。

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另外万牺，作者又檢測(cè)了SNORD50A敲低細(xì)胞中的其他Asns、Egr1和Ptch2基因mRNA的表達(dá)情況和PAS活性洽腺，結(jié)果表明SNORD50A敲低后這些基因的初始轉(zhuǎn)錄本不受影響而成熟的mRNA含量明顯增加了（下左圖）脚粟，PAS活性也明顯增強(qiáng)（下右圖）。說明SNORD50A調(diào)節(jié)一些內(nèi)源性mRNA的加工蘸朋。

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3核无、snoRNA通過阻斷Fip1與PAS的互作抑制mRNA 3’端的加工

在上一部分中作者已經(jīng)證明了SNORD50A能調(diào)控mRNA的3’末端的加工，那么它是如何對(duì)Mrna 3’末端的加工進(jìn)行調(diào)節(jié)的呢藕坯？

作者首先通過RNA pull-down實(shí)驗(yàn)獲取與snoRNA結(jié)合的蛋白進(jìn)行WB檢測(cè)幾種與RNA加工相關(guān)的特異因子（CPSF）（下圖A）团南，然后再用這些因子進(jìn)行Clip檢測(cè)snoRNA的富集（下圖B），結(jié)果表明四種snoRNA都與Fip1特異結(jié)合炼彪。然后作者對(duì)細(xì)胞SNORD50A進(jìn)行干擾后細(xì)胞裂解液與P32-labeled SVLpre-mRNA孵育吐根，再用Fip1抗體進(jìn)行IP檢測(cè)CPSF和pre-mRNA的結(jié)合，結(jié)果表明SNORD50A敲低后Fip1與pre-mRNA結(jié)合增加（下圖C）辐马。

另外拷橘，作者用生物素標(biāo)記的含P32標(biāo)記的SVL-PAS與P32標(biāo)記的SNORD50A進(jìn)行pull-down檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SVL-PAS與snoRNA不結(jié)合（下圖D）。EMSA結(jié)果表明SNORD50A對(duì)SVL-PAS與Fip1的結(jié)合具有競(jìng)爭(zhēng)作用（下圖E）喜爷，即SNORD50A與Fip1結(jié)合后阻斷SVL-PAS與Fip1的結(jié)合冗疮。

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文獻(xiàn)原文：ChunliuHuang,Junjie Shi1,Yibin Guo,et al.A snoRNA modulates mRNA 3end processing and regulatesthe expression of a subset of mRNAs.Nucleic Acids Research,2017,15,8647–8660