河南省預(yù)防型疫苗工程技術(shù)研究中心，河南省生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)研究院與河南省生物醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心等多個(gè)團(tuán)隊(duì)通力合作，在生物制品學(xué)雜志發(fā)表關(guān)于生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)狂犬病病毒的成果，該研究為150 L生物反應(yīng)器高密度微載體工藝放大提供了技術(shù)支持，為后期開發(fā)更大規(guī)模高密度微載體反應(yīng)器工藝奠定基礎(chǔ)。
狂犬病病毒（rabies virus, RABV）是致死率極高的病毒资盅，分布于多種哺乳動(dòng)物宿主，這些宿主與人類之間存在復(fù)雜的關(guān)系踊赠。目前呵扛，RABV引起的狂犬病每年造成約5.9萬人死亡。迄今為止筐带，狂犬病發(fā)病后幾乎無治愈病例今穿，主要通過提前接種疫苗來進(jìn)行預(yù)防。我國(guó)每年人用狂犬病疫苗的消耗量約1600萬人份伦籍。對(duì)于狂犬病疫苗的制備荣赶，RABV大規(guī)模擴(kuò)增是關(guān)鍵技術(shù)，也是決定成本的重要因素之一鸽斟。目前主要采用生物反應(yīng)器（借助微載體）培養(yǎng)Vero細(xì)胞拔创，擴(kuò)增RABV，再純化病毒等步驟制備狂犬病疫苗富蓄，具有成本較低剩燥、技術(shù)較易控制等優(yōu)點(diǎn)，本研究在30 L生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)上立倍，嘗試采用150 L生物反應(yīng)器灭红、高密度微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞，擴(kuò)增RABV口注，以期為規(guī)谋淝埽化培養(yǎng)RABV，制備狂犬病疫苗提供參考寝志。
應(yīng)用30 L和150 L生物反應(yīng)器娇斑，以灌流方式培養(yǎng)Vero細(xì)胞和CTN-1V株RABV, Cytodex-1微載體濃度20 g/L策添，培養(yǎng)溫度36～38℃，DO 20%～60%毫缆，pH 7.0～7.4唯竹，連續(xù)13 d收獲病毒液，培養(yǎng)過程中取樣檢測(cè)細(xì)胞密度苦丁、病毒滴度浸颓，并對(duì)病毒收獲液進(jìn)行無菌和支原體檢查及抗原、宿主細(xì)胞蛋白（host cell protein, HCP）旺拉、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）产上、DNA殘留量檢測(cè)。結(jié)果30 L和150 L生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)密度均可達(dá)1.2×107個(gè)/mL以上蛾狗，在培養(yǎng)過程中各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞密度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.225～2.173, P=0.096～0.833）晋涣。2種規(guī)模生物反應(yīng)器病毒收獲液均在感染后6 d達(dá)最高病毒滴度(8.5 lgLD50/mL)，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.000, P=0.374）淘太。2種規(guī)模生物反應(yīng)器病毒收獲液的抗原姻僧、HCP规丽、BSA和DNA殘留量基本一致蒲牧。可用150 L生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)RABV赌莺，病毒收獲液符合《中國(guó)藥典》三部（2020版）相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)冰抢。
搖瓶工藝
搖瓶中細(xì)胞培養(yǎng)至第4天時(shí)，呈致密單層艘狭，接種RABV毒種挎扰。
生物反應(yīng)器工藝
細(xì)胞培養(yǎng)過程中2種規(guī)模生物反應(yīng)器的細(xì)胞密度變化趨勢(shì)相似。細(xì)胞培養(yǎng)至第4天巢音，密度達(dá)12.0×106個(gè)/m L以上遵倦，30 L生物反應(yīng)器的細(xì)胞密度（12.3×106個(gè)/m L）高于150 L生物反應(yīng)器（12.1×106個(gè)/m L），但二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.138, P=0.319）官撼。接毒后細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)一段時(shí)間梧躺，2種規(guī)模生物反應(yīng)器細(xì)胞密度均在第6天達(dá)最高，分別為13.3×106和13.0×106個(gè)/m L傲绣。隨著病毒培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)掠哥，細(xì)胞密度呈下降趨勢(shì)。2種規(guī)模生物反應(yīng)器在培養(yǎng)過程中各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞密度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.225～2.173, P=0.096～0.833）秃诵。細(xì)胞密度變化曲線見圖1续搀；接種細(xì)胞后，細(xì)胞貼附在微載體表面菠净，形態(tài)飽滿禁舷，無游離細(xì)胞彪杉，第4天呈致密單層，見圖2榛了；接種病毒后在讶，細(xì)胞逐漸發(fā)生病變，從微載體上脫落霜大，死亡构哺，第13天大部分細(xì)胞已脫落，見圖3战坤。
病毒收獲液檢定病毒滴度變化
30和150L生物反應(yīng)器中細(xì)胞感染2 d后收獲的第1組病毒液滴度平均值分別為（7.60±0.14）和（7.63±0.09)lg LD50/m L曙强；感染4 d后，2種規(guī)模生物反應(yīng)器的細(xì)胞密度均下降途茫、收獲液病毒滴度均增加碟嘴，均在感染后6 d達(dá)最高病毒滴度，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.000, P=0.374）囊卜。隨后病毒滴度緩慢下降娜扇，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，2種規(guī)模生物反應(yīng)器的收獲液病毒滴度均為（7.53±0.12)lg LD50/m L栅组。見表1和圖4雀瓢。表明從30 L放大至150 L的工藝可獲得高滴度的病毒收獲液。
結(jié)果
搖瓶培養(yǎng)目前主要作為細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增步驟玉掸，直接應(yīng)用于規(guī)娜恤铮化生產(chǎn)越來越少。單個(gè)搖瓶產(chǎn)能較小司浪，規(guī)牟匆担化生產(chǎn)需至少數(shù)十個(gè)搖瓶同步進(jìn)行，導(dǎo)致人工操作復(fù)雜且強(qiáng)度大啊易，存在一定的暴露操作風(fēng)險(xiǎn)吁伺。搖瓶培養(yǎng)技術(shù)不再是規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)展方向租谈。
應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞是疫苗制備的關(guān)鍵技術(shù)篮奄，是重要的發(fā)展方向之一。且生物反應(yīng)器易操控垦垂，適合規(guī)幕掳幔化放大，應(yīng)用反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞具有明顯優(yōu)勢(shì)劫拗。生物反應(yīng)器培養(yǎng)可獲得更高的收益率间校，生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)可以完成更多工作，可監(jiān)測(cè)和控制的參數(shù)數(shù)量基于生物反應(yīng)器中的傳感器和控制元件數(shù)量页慷，可以更好的進(jìn)行培養(yǎng)工藝條件的篩選憔足，優(yōu)化胁附。工藝簡(jiǎn)單、操作靈活滓彰，有良好的適用性控妻；培養(yǎng)工藝容易放大，可為生物體生長(zhǎng)和增殖提供均質(zhì)的環(huán)境揭绑；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定弓候，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)；管路布置較為簡(jiǎn)單他匪，能提供較好的無菌條件菇存，細(xì)胞生長(zhǎng)過程中不易污染。該研究在30 L生物反應(yīng)器規(guī)模實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上邦蜜，實(shí)現(xiàn)了在150 L生物反應(yīng)器進(jìn)行微載體濃度20 g/L的Vero細(xì)胞培養(yǎng)依鸥，并接種RABV，細(xì)胞病變過程正常且可控悼沈，病毒收獲液滴度最高可達(dá)8.5 lg LD50/m L, 30和150 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)的終末代細(xì)胞各項(xiàng)檢測(cè)均符合《中國(guó)藥典》三部（2020版）要求贱迟，為后期開發(fā)更大規(guī)模高密度微載體生物反應(yīng)器工藝奠定基礎(chǔ)。
