背景介紹
皮膚覆蓋全身表面韩脑，是人體最大的器官之一，可分為表皮與真皮兩層粹污，并借皮下組織與深層組織連接段多。表皮位于皮膚淺層，由角化的復(fù)層扁平上皮組成壮吩。細(xì)胞主要分為兩類：一類是角質(zhì)形成細(xì)胞进苍，約占表皮細(xì)胞的80%以上，且分層排列鸭叙；另一類細(xì)胞為非角質(zhì)形成細(xì)胞觉啊，數(shù)量較少，散在分布于角質(zhì)形成細(xì)胞之間沈贝。真皮位于表皮下杠人，主要由致密結(jié)締組織組成，有許多彈力纖維和膠原纖維宋下，故有彈性和韌性嗡善。真皮是皮膚內(nèi)發(fā)生免疫反應(yīng)的主要部位，參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞杨凑、T細(xì)胞滤奈、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞撩满、成纖維細(xì)胞等蜒程。
在皮膚中細(xì)胞之間的連接主要通過橋粒與半橋粒連接，富含膠原纖維和彈性蛋白伺帘。因此在皮膚組織的解離過程中我們選擇使用DispaseⅡ和膠原酶Ⅳ昭躺。DispaseⅡ?yàn)橹行缘牡鞍酌福伤饫w連蛋白和IV型膠原蛋白伪嫁，具有切割亮氨酸-苯丙氨酸鍵的特異性领炫；該酶非常溫和，不會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損傷张咳。
實(shí)驗(yàn)儀器及耗材
實(shí)驗(yàn)步驟
1.皮膚組織放置在4℃ 預(yù)冷的1×DPBS溶液中進(jìn)行清洗帝洪，剔除非目標(biāo)組織成分。
2.將皮膚切成0.5cm3大小的顆粒脚猾，清洗去除碎屑葱峡。
3.在皮膚表皮層厚度200μm的地方開一個(gè)小口，有助于酶解液的滲入砰奕。
4.將處理好的皮膚組織放進(jìn)含有50mL RPMI + 2U/ml disase II的離心管中。
5.封口膜封住管口，將含有酶解液和皮膚組織的離心管置于37℃军援，60rpm/min的水浴鍋中進(jìn)行消化仅淑。
6.37°水浴 1 小時(shí)，期間每10分鐘翻轉(zhuǎn)離心管一次胸哥，以確保皮膚充分接觸解離液涯竟。
7.1小時(shí)以后使用1×DPBS潤(rùn)洗以去除第一輪酶解液。
8.使用鑷子和鋒利的刀片將表皮從真皮層剝離烘嘱，剝離時(shí)在冰浴的1×DPBS中操作昆禽。
9.將表皮置于含有20ml?RF10 （RPMI + 10% FBS ?+ 1% Penicillin-Streptomycin + 1% L-Glutamine）的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。加入1.6 mg/ml膠原酶；將其放入37℃瓦糟，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜或者超過12小時(shí)孵育隐岛。
10.對(duì)真皮細(xì)胞重復(fù)操作9。
11.使用移液管收集上清并用孔徑100μm的過濾器過濾奄容，收集真皮和表皮中的細(xì)胞。
12.用RF10溶液潤(rùn)洗細(xì)胞培養(yǎng)皿以獲得殘留的細(xì)胞，收集到的溶液通過40μm細(xì)胞過濾器過濾北发。
13.收集到的細(xì)胞懸液，通過400g喷屋，離心5分鐘琳拨，離心收集，棄上清后用1×DPBS重懸細(xì)胞屯曹。
14.通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞活性大于等于85%狱庇，背景干凈，結(jié)團(tuán)率小于5%恶耽，細(xì)胞量大于等于5萬密任；可用于后續(xù)單細(xì)胞測(cè)序建庫(kù)實(shí)驗(yàn)。
制備結(jié)果
注意：皮膚細(xì)胞懸液制備中容易出現(xiàn)結(jié)團(tuán)率偏高的情況偷俭。我們可以通過DNAseI和其他類型膠原酶輔助解離降低結(jié)團(tuán)率浪讳，或者通過結(jié)團(tuán)細(xì)胞團(tuán)和單個(gè)細(xì)胞間沉降系數(shù)差進(jìn)行離心沉降，從而獲取低結(jié)團(tuán)的細(xì)胞懸液涌萤。再者需要保證足夠的解離時(shí)間淹遵，解離時(shí)間較短或者機(jī)械輔助不足時(shí)獲取的角質(zhì)層細(xì)胞比例較高
以上內(nèi)容來自生信技能樹和聯(lián)川生物，有小伙伴如果照著這個(gè)步驟做了方便的話留言反饋效果如何~（帶圖的最好）
