實驗步驟：
- 取1.5克懸浮培養(yǎng)的玉米愈傷組織，加入15ml的酶液（4% Cellulase RS Yakult, 1% Rhozyme in KMC salt solution）.在溫控搖床上30度溫育3-4小時思灌。
- 先用100um的俺叭，然后再用50um的濾網(wǎng)對消化過的組織進行過濾。
- 過濾后的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到12ml的離心管里泰偿，緩慢順壁倒入1-2ml的蔗糖溶液（0.6Msucrose熄守，0.5% MES，pH6.0）耗跛，使蔗糖溶液在原生質(zhì)體下方形層裕照。離心60-100g 10mins。原生質(zhì)體會在兩相中間成環(huán)调塌。
- 收集原生質(zhì)體晋南，13/14 KMC溶液進行沖洗（這里應(yīng)該是指如收集的原生質(zhì)體為1ml，則加入13ml的KMC）羔砾，離心负间，加入6/7 KMC溶液清洗兩次。
- 重懸原生質(zhì)體于原生質(zhì)體培養(yǎng)基中姜凄。
KMC buffer : 8.65g/l KCl, 12.5 g/l CaCl2, 16.47 g/l MgSO4, 5g/l MES
Comment：
o 過于老舊政溃，Rhozyme似乎已停產(chǎn)，找不到生產(chǎn)廠家态秧。但查到其乃是一種hemicellulase董虱，可以直接用其他hemicellulase（如Macerozyme R10）代替。
o 溫育時間長屿聋，有3到4個小時空扎。也沒有提到搖床速度藏鹊∪蠹ィ可嘗試50rpm，分別在1.5hr和2hr時進行鏡檢盘寡，檢查細胞的解離速度楚殿。一旦產(chǎn)生足夠單細胞即停止酶解，進行清洗竿痰。
o 目前蔗糖梯度對于基因表達的影響尚未知脆粥，可嘗試用KMC直接進行清洗，去除蔗糖梯度離心成環(huán)步驟影涉。
o 可用于單子葉植物变隔，特別是禾本科愈傷組織的原生質(zhì)制備。
方法來源：Shillito, et al., (1989). Regeneration of Fertile Plants from Protoplasts of Elite Inbread Maize. Nature Biotechnology, 7(6), 581–587. doi:10.1038/nbt0689-581
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