文獻(xiàn)：《PRMT2 and ROR?Expression Are Associated With Breast Cancer Survival Outcomes》

解讀的目的：積累癌癥的背景知識+該文章的研究目的--用到什么分析---結(jié)果的圖如何解讀---最后看看能不能復(fù)現(xiàn)一下代碼凿宾。

一些名詞的釋義：

• PRMT2：Proteinarginine methyltransferases蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMT）甲基化組蛋白上的精氨酸殘基和在許多細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用的靶轉(zhuǎn)錄因子沛申。蛋白質(zhì)精氨酸甲基化由 PRMTs 調(diào)控侣姆，常見的一種翻譯后修飾背零，已知的 PRMTs 家族有9種（PRMT1哺壶、PRMT2躲撰、PRMT3、PRMT6弧圆、PRMT8赋兵、CARM1、PRMT5墓阀、PRMT9毡惜、PRMT7），分別催化形成單甲基化（MMA）斯撮，對稱二甲基化（SDMA）和非對稱二甲基化（ADMA）。近些年的研究證明了 PRMTs 調(diào)控了表觀遺傳介導(dǎo)的基因表達(dá)扶叉、mRNA 剪接勿锅、DNA 損傷應(yīng)答、干細(xì)胞功能以及免疫反應(yīng)等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物學(xué)過程

• RORγ：

• MCF-7 cancer cell ：人乳腺癌細(xì)胞枣氧。MCF7細(xì)胞保留了多個分化了的乳腺上皮的特性溢十，包括：能通過胞質(zhì)雌激素受體加工雌二醇并能形成圓形復(fù)合物。MCF7細(xì)胞含有Tx-4癌基因达吞；腫瘤壞死因子α可以抑制MCF7細(xì)胞的生長张弛，抗雌激素處理MCF7 細(xì)胞能調(diào)變IGFBP'S的分泌。

• IDC：Invasive Ductal Carcinoma 浸潤性導(dǎo)管癌

• DMFS：無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率(DMFS)總生存率(OS)

前言：

研究目的：PRMT轉(zhuǎn)移酶可以使得組蛋白的精氨酸殘基和靶轉(zhuǎn)錄因子甲基化，在基因轉(zhuǎn)錄吞鸭、mRNA剪接等過程中是有作用的寺董。最近有研究表明PRMT依賴性的表觀遺傳標(biāo)記和腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移是有相關(guān)性的。但是PRMT2依賴性信號在乳腺癌中的作用仍不清楚刻剥。所以作者的目的是要研究PRMT2依賴性信號在乳腺癌中的作用遮咖。

前人的幾個研究：

• 1998年發(fā)現(xiàn)了PRMT2

• 表現(xiàn)出弱I型精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性

• PRMT2可以作為轉(zhuǎn)錄輔因子，參與許多類固醇激素/核受體的轉(zhuǎn)錄活動造虏，包括雌激素受體（ER）御吞、維甲酸受體和雄激素受體

• PRMT2還被發(fā)現(xiàn)參與β連環(huán)蛋白介導(dǎo)的基因基因表達(dá)

• PRMT2影響參與細(xì)胞程序性死亡和脂多糖誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的核因子-B信號通路

• PRMT2與如異質(zhì)核核糖核蛋白腺病毒早期1B區(qū)相關(guān)蛋白（E1B-AP5）有相互作用

• PRMT2與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白相互作用

• PRMT2的減少以雌激素依賴的方式增加E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F1）的表達(dá)，并改變E2F1依賴基因的表達(dá)

• PRMT2表達(dá)的增加被證明與ER陽性相關(guān)漓藕，表明PRMT2在雌激素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中的潛在作用以及可能參與乳腺癌的病因和進(jìn)展

研究方法和分析

• 購買-培養(yǎng)MCF-7 細(xì)胞

• siRNA實驗-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48小時

• 微陣列數(shù)據(jù)分析：對照和PRMT2敲除RNA樣本之間的差異表達(dá)基因正程罩椋化

• MCF-7細(xì)胞的RNA提取分離----反轉(zhuǎn)錄---RT-qPCR

• WB實驗，蛋白印跡

• 乳腺癌微陣列數(shù)據(jù)集分析：做生存分析享钞。包括有54個公開的乳腺癌數(shù)據(jù)

• 蛋白相互作用檢驗背率。用PPI network

• WGCNA 和GO分析

• 乳腺癌組織樣本的TLDAs and RT-qPCR

• 用TLDA進(jìn)行NR表達(dá)譜分析

• 傷口愈合遷移試驗

• DNA修復(fù)分析：紫外線損傷分析+綠色熒光蛋白（GFP）分析

得出來的結(jié)果：

1、與正常乳腺組織相比嫩与，PRMT2在人類乳腺癌中顯著降低寝姿。

作者采用了（66個樣本的IDC tissues---50個正常乳腺組織的樣本）的PRMT2 mRNA表達(dá)量的比較。

從圖里面可以看到的是划滋，乳腺癌的PRMT2表達(dá)量確實比正常乳腺組織的要低饵筑。

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2、处坪、PRMT2依賴性基因表達(dá)調(diào)節(jié)乳腺癌中涉及的多種途徑（包括細(xì)胞周期和DNA修復(fù)）

作者為了驗證PRMT2缺失對MCF-7細(xì)胞的影響根资。用siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48個小時。干擾PRMT2同窘，使其沉默渺绒。+microarray analysis。

作者做了一系列的比對實驗來證明：

• PRMT2缺失远搪，對TP53影響不大

• PRMT2缺失永毅，p21mRNA表達(dá)量增加

• PRMT2缺失，cyclin D1mRNA表達(dá)顯著減少

結(jié)果1：顯示的丧没，正常細(xì)胞和PRMT2-siRNA比較鹰椒。是證明轉(zhuǎn)染成功的，PRMT2已經(jīng)被干擾沉默了呕童。

WB也是證明了這點漆际。PRMT2的蛋白水平也是降低的了。

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結(jié)果2：觀察到PRMT2-siRNA-1顯著減弱所有8種異構(gòu)體的表達(dá)

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結(jié)果3：差異化分析（篩選條件：>2-foldchange, P<.05)

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結(jié)果4：前10個上調(diào)和下調(diào)基因夺饲。其中PRMT2在里面

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結(jié)果5：通路分析奸汇。

Ingenuity通路分析顯示PRMT2依賴基因參與多種功能和細(xì)胞通路施符，包括細(xì)胞周期控制、DNA復(fù)制/修復(fù)和致癌擂找。

IPA（Ingenuity Pathway Analysis戳吝，通路分析軟件）是一款基于云計算的圖形化界面生物信息學(xué)軟件，能夠從生物學(xué)通路角度將組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析婴洼。

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結(jié)果6：重要的上游調(diào)節(jié)因子骨坑。

CCND1、TP53柬采、 CDKN1A (p21)

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結(jié)果7：接著做RT-qPCR欢唾。

目的是想對結(jié)果6的上游調(diào)節(jié)因子進(jìn)一步的驗證。

結(jié)果是顯示粉捻。敲除了PRMT2的MCF-7細(xì)胞和正常細(xì)胞對比礁遣。

①、TP53并沒有明顯的顯著的變化

②肩刃、p21mRNA levels上升了祟霍。protein expression也上升了。

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結(jié)果8：作者同時也用了其他的細(xì)胞系進(jìn)行一樣的實驗盈包。

T47D（ER+ve）

MDA231 ER-ve

主要是觀察p21的變化沸呐。

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結(jié)果9：其他的一些驗證實驗。

也都是證明了PRMT2的缺失也導(dǎo)致p21 mRNA表達(dá)顯著增加

結(jié)果10：相同的實驗呢燥，也是去證明了崭添。PRMT2的缺失會導(dǎo)致cyclin D1mRNA表達(dá)顯著減少

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• PRMT2依賴性基因表達(dá)調(diào)節(jié)乳腺癌中涉及的多種途徑（包括細(xì)胞周期和DNA修復(fù)）

3、ppi網(wǎng)絡(luò)

作者的目的是想通過畫出ppi網(wǎng)絡(luò)叛氨，來確認(rèn)PRMT2調(diào)節(jié)基因是否形成了具有定義生物學(xué)功能的基因的互連子網(wǎng)絡(luò)呼渣。

作者是用了一個“a fast heuristic search algorithm capable”更快的算法？FDR是0.01

結(jié)果是：確定了一個重要的子網(wǎng)絡(luò)寞埠，包括499個基因（節(jié)點）和5517個基因之間的連接屁置。而且在這個子網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)一組高度互聯(lián)的PRMT2下調(diào)基因的網(wǎng)絡(luò)仁连。這一組基因是動粒和DNA修復(fù)途徑的核心成員蓝角。

• 紅色圈出部分是PRMT2依賴基因的蛋白質(zhì)相互作用圖〔篮總圖

• 下面的具體的子網(wǎng)絡(luò)圖是：動粒和DNA修復(fù)途徑的基因之間的關(guān)鍵功能相互作用

• 紅色表示PRMT2敲除細(xì)胞中的上調(diào)帅容，而藍(lán)色表示PRMT2敲除細(xì)胞中的下調(diào)

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同時還通過qPCR對ABL1,AURKB,BRCA1,CCNB1,CDK1, SKP2等幾個差異表達(dá)的關(guān)鍵基因進(jìn)行驗證。

結(jié)果是表明了這幾個基因確實是存在差異表達(dá)伍伤。

ABL1是顯著上調(diào)，其他的幾個是顯著下調(diào)遣钳。這些通路在癌癥中是會被解除的扰魂，與染色體不穩(wěn)定和侵襲性的乳腺癌有關(guān)。

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三、PRMT2表達(dá)調(diào)節(jié)核受體（NRs）劝评、肝受體同源物-1（LRH-1）和雄激素受體γ的表達(dá)姐直，并影響乳腺癌細(xì)胞遷移：PRMT2和RORγ在乳腺癌中呈負(fù)相關(guān)。

1蒋畜、在圖2B声畏，里面，是可以看到姻成。在PRMT2沉默的MCF-7細(xì)胞中插龄。編碼RORγ的mRNA表達(dá)顯著增加。top10之一科展。ROR是屬于NR家族的均牢。

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然后提取整個NR超家族的表達(dá)。如圖： fold change用的是log10 才睹，而不是log2徘跪。倍數(shù)還挺大的了。

變化最大的兩個是：RORγ和LRH-1

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作者然后有做了一個驗證實驗琅攘；TLDA垮庐，（低密度基因芯片 (TLDA)實驗）沒了解過這個怎么做的。

也還是證明了坞琴。RORγ和LRH-1的上調(diào)和下調(diào)確實變化很大哨查。

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結(jié)果：證明了PRMT2的沉默會使得RORγ的上調(diào)，而前人的研究已經(jīng)證明了RORγ表達(dá)已被證明與人類乳腺癌的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)置济。也就是說PRMT2表達(dá)水平影響乳腺癌細(xì)胞遷移

2解恰、傷口愈合試驗表明，PRMT2缺失的MCF-7細(xì)胞遷移減少

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3浙于、作者還利用了50 breast cancer的樣本去驗證PRMT2和RORγ之間是否存在相關(guān)性护盈。

結(jié)果是： ER+ve patients中是存在相關(guān)性的，但是ER-ve樣本中就是不存在的羞酗。

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4腐宋、乳腺癌患者的RORγ表達(dá)增加會增加DMFS

作者為了進(jìn)一步評估RORγ表達(dá)對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者臨床預(yù)后的影響。所以對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了一個K-M生存分析檀轨。

三個數(shù)據(jù)：breast cancer胸竞、MAINZ、UNC

結(jié)果：都是是RORγ高表達(dá)的参萄，病人會有更好的生存率卫枝。

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然后再做一個 HR analysis？讹挎？校赤？吆玖？（沒接觸過）

使用95%置信區(qū)間和Cox回歸

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做這個 HR 分析的結(jié)果也是：

• 高RORγ表達(dá)會增加病人的生存率
• 高PRMT2表達(dá)，會降低病人生存率马篮。

四沾乘、在人類乳腺癌隊列中，PRMT2依賴性基因與生存結(jié)果DMFS顯著相關(guān)

作者在這一步浑测，想再驗證一下翅阵，整個-PRMT2依賴性基因和DMFS是否有關(guān)聯(lián)，和上一步的結(jié)果是否能相互驗證迁央。

用到的三個數(shù)據(jù)集：NKI, TRANSBIG, UNT

第一個：所有的PRMT2依賴性基因和DMFS的相關(guān)性掷匠。

結(jié)果是:低PRMT2表達(dá)，確實會增加病人生存率dmfs漱贱。（紅色的線）

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第二個：PRMT2-down下調(diào)的基因和DMFS的相關(guān)性

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第三個：PRMT2-down上調(diào)的基因和DMFS的相關(guān)性

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五槐雾、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析識別與乳腺癌生存相關(guān)的共表達(dá)基因集和轉(zhuǎn)錄模塊

WGCNA是一種識別高度相關(guān)基因模塊的方法，作者用WGCNA應(yīng)用于乳腺癌表達(dá)數(shù)據(jù)幅狮，想去檢測和乳腺癌中PRMT2表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄回路模塊募强。

結(jié)果是：

①、生成7個模塊崇摄。每一個模塊是1-2個通路的集合擎值。模塊7是：細(xì)胞周期檢查點、有絲分裂細(xì)胞周期控制逐抑。模塊3是：細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞粘附顯著相關(guān)鸠儿。

②、可以看到的是：在通路模塊1厕氨、2进每、6、7里面：PRMT2和RORγ之間存在負(fù)相關(guān)

③命斧、癌癥的轉(zhuǎn)移和增值的特性相對應(yīng)的泛癌基因包括有：①田晚、和EMT相關(guān)的基因、②国葬、和染色體不穩(wěn)定的動粒等相關(guān)的基因贤徒。

而這些基因和通過WGCNA分出來的七個模塊里面的紅色模塊7、紫色模塊3的基因是高度重合的汇四。

--也就是說接奈，PRMT2和RORγ在這兩個泛癌基因模塊里面，是存在負(fù)相關(guān)的通孽。

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右圖C是如何做的序宦？

作者是：用了兩種方法：

①、GO terms和模塊基因之間的重疊的超幾何測試背苦？挨厚？堡僻？ ②糠惫、基因集富集分析疫剃，以測量GOterms是否顯示模塊關(guān)聯(lián)的一致趨勢？硼讽？巢价？？固阁？

還有這個圖是怎么看的壤躲？怎么畫的？不知道备燃。

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2碉克、作者通過前面，確定了模塊7的重要性并齐，現(xiàn)在想進(jìn)一步去探究模塊7的基因和臨床是否有關(guān)漏麦，做了一個生存分析。

高表達(dá)的模塊7基因况褪，確實是會降低生存率撕贞。

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后面作者繼續(xù)做了比較分析。PRMT2-down的基因的生存分析测垛∧笈颍可以看出是，PRMT2下調(diào)信號升高食侮，會降低生存率号涯。

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最后，作者再進(jìn)一步去探究：PRMT2和管腔A亞型---管腔B亞型锯七，誰的影響

更大链快。

結(jié)果：與管腔A腫瘤相比，管腔B腫瘤中PRMT2down標(biāo)記基因的平均表達(dá)顯著高于管腔A腫瘤起胰。

五久又、PRMT2缺失增強紫外線誘導(dǎo)DNA損傷的修復(fù)

作者在PPI相互作用組和WGCNA分析PRMT2耗竭后的DNA修復(fù)途徑。所以作者想驗證一下效五，PRMT2是否對DNA損傷的修復(fù)有影響地消？

作者用紫外線誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞，

結(jié)果畏妖，直接看48小時的脉执，PRMT2表達(dá)降低改善了紫外線照射后CPD損傷的清除。也就是說PRMT2缺失增加了MCF-7乳腺癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)

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六戒劫、討論半夷，結(jié)論

• PRMT2在人類乳腺癌中顯著降低

• PRMT2缺失減少細(xì)胞遷移

• PRMT2與RORγ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

• PRMT2依賴性基因表達(dá)影響無轉(zhuǎn)移生存

• PRMT2依賴性基因子集參與細(xì)胞周期檢查點婆廊、有絲分裂細(xì)胞周期控制的G1/S轉(zhuǎn)換和DNA修復(fù)。這些回路與EMT巫橄、增殖和CIN相關(guān)的泛癌基因特征相關(guān)淘邻，并包括動粒相關(guān)基因

自己的一些想法：

1、背景知識的缺乏湘换。我這樣學(xué)生信的話宾舅，實驗室的課題只有環(huán)境DNA的，也就是和宏基因組差不多的彩倚。除了這個切入點筹我，但是這個環(huán)境DNA的是太偏門了，找工作不好找帆离。我還是的另選一個切入點去學(xué)習(xí)蔬蕊。癌癥應(yīng)該是生信里面一個比較熱門的課題得了。

如果我要以癌癥作為切入點去學(xué)生信哥谷，那我就得補很多很多的背景知識岸夯。縮小一點呼巷，乳腺癌作為切入點囱修？

2、王悍，大概可以摸清作者的思路

①破镰、先確定了PRMT2在人類乳腺癌中顯著降低

②、然后做差異分析压储、通路分析鲜漩，和多個實驗，去確定了PRMT2依賴性基因表達(dá)調(diào)節(jié)乳腺癌中涉及的多種途徑（包括細(xì)胞周期和DNA修復(fù)）

③集惋、再接著做ppi網(wǎng)絡(luò)孕似，找到了一組高度互聯(lián)的PRMT2下調(diào)基因的網(wǎng)絡(luò)。這一組基因是動粒和DNA修復(fù)途徑的核心成員刮刑。（動粒和DNA修復(fù)途徑和癌癥的是相關(guān)的通路）

④喉祭、接著再第二步做差異分析的時候，發(fā)現(xiàn)在PRMT2沉默的MCF-7細(xì)胞中雷绢。編碼RORγ的mRNA表達(dá)顯著增加泛烙，然后通過TLDA驗證。

⑤翘紊、進(jìn)一步評估RORγ表達(dá)對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者臨床預(yù)后的影響蔽氨，得出結(jié)論是RORγ高表達(dá)的，病人會有更好的生存率。也就是說得出“PRMT2降低--RORγ升高---生存率升高”這樣的關(guān)系

⑥鹉究、后面通過整個-PRMT2依賴性基因宇立、PRMT2-up、PRMT2-down基因集去做生存分析自赔，繼續(xù)驗證⑤里面的妈嘹，PRMT2表達(dá)降低，可以提升病人生存率

⑦匿级、后面再通過WGCNA識別出7個基因模塊蟋滴。重要的是紅色模塊7、這個模塊和癌癥的增值和轉(zhuǎn)移的的泛癌基因有很多重合痘绎。也就說PRMT2和RORγ在這兩個泛癌基因模塊里面，是存在負(fù)相關(guān)的

⑧肖粮、最后作者通過紫外誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞孤页，去證明PRMT2缺失增加了MCF-7乳腺癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)。DNA損傷修復(fù)通路也是和癌癥相關(guān)的涩馆。

3行施、存在的問題是：

①、濕實驗的魂那，很多不會蛾号，甚至沒接觸過。：①涯雅、養(yǎng)細(xì)胞 ②鲜结、siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 ③、傷口愈合遷移試驗 ④活逆、紫外線損傷分析實驗精刷。

這部分的話，我現(xiàn)在的實驗室是沒有的蔗候。我得去問我宿友實驗室那邊看一下怒允，他們那邊有養(yǎng)細(xì)胞的，起碼要熟悉流程锈遥∪沂拢或者b站上相關(guān)的實驗課程。

②所灸、整個生信分析：

差異分析

通路分析

ppi網(wǎng)絡(luò)

生存分析

HR analysis--丽惶？？庆寺？沒接觸過

WGCNA--蚊夫？？聽過懦尝，但是沒做過