2、 天罡星 玉麒麟 盧俊義

2018年12月的NC文章：Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single cell RNA sequencing

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附件在：https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1038%2Fs41467-018-07582-3/MediaObjects/41467_2018_7582_MOESM1_ESM.pdf

利用Smart-seq2探索癌癥成纖維細(xì)胞CAFs的功能和空間異質(zhì)性

看一篇文章的時(shí)候忿晕，里面會(huì)有很多詞語(yǔ)是陌生的稠炬，這時(shí)就需要去了解背景知識(shí)

研究背景

傳統(tǒng)的腫瘤研究是單純以腫瘤細(xì)胞為中心务傲，但是過(guò)去的幾十年中研究者對(duì)腫瘤微環(huán)境與惡性表征的聯(lián)系越來(lái)越重視狈癞。探索腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境的相互作用為靶向治療提供了新方向。本文的目的是利用可以尋找更多基因的smart-seq2技術(shù)對(duì)小鼠乳腺癌CAFs的亞群進(jìn)行鑒定峦萎，展示了時(shí)空分布情況屡久；還探究了人類(lèi)與小鼠CAFs亞型一致性，為未來(lái)靶向CAFs藥物研發(fā)或診斷標(biāo)志物篩選提供基礎(chǔ)爱榔。

名詞解釋

CAF（cancer-associated fibroblast）：
國(guó)際腫瘤學(xué)雜志 ：癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞是數(shù)量最豐富的基質(zhì)細(xì)胞被环，在腫瘤微環(huán)境中通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間相互接觸，并在各種可溶性因子的作用下详幽，促進(jìn)上皮細(xì)胞及其他細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化筛欢。目前發(fā)現(xiàn)，它在許多癌癥（包括乳腺癌唇聘、胰腺癌版姑、肝癌）的微環(huán)境中最常見(jiàn)。

它是具有高度的異質(zhì)性的細(xì)胞群迟郎，不同的細(xì)胞亞群可能起源于不同的前體細(xì)胞剥险，如固有成纖維細(xì)胞、腫瘤上皮細(xì)胞宪肖、腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞表制、骨髓來(lái)源細(xì)胞健爬、其他間充質(zhì)細(xì)胞等。
它在腫瘤形成中的作用：

• 重塑纖維間質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)
• "草船借箭"=》細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與非腫瘤細(xì)胞(如免疫細(xì)胞)的整合素受體結(jié)合么介，將細(xì)胞外基質(zhì)蛋白募集到腫瘤細(xì)胞處娜遵，發(fā)生相互作用，繼而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲
• 高密度細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致組織間隙液壓升高夭拌，阻礙藥物傳遞與吸收
• CAFs以細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的形式分泌致瘤信號(hào)魔熏，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖鸽扁、遷移
• CAFs分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、白介素-6(Interleukin-6镶骗，IL-6)桶现，促進(jìn)腫瘤對(duì)化療、酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生抗藥性

關(guān)于它的綜述：The biology and function of fibroblasts in cancer.

TME（Tumor Microenvironment）：腫瘤微環(huán)境鼎姊，包括了腫瘤細(xì)胞骡和、基質(zhì)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)、免疫細(xì)胞相寇、細(xì)胞的分泌產(chǎn)物（如細(xì)胞因子和趨化因子）慰于、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、腫瘤和非腫瘤細(xì)胞代謝產(chǎn)物(如過(guò)氧化氫)唤衫、特定生理環(huán)境(供養(yǎng)婆赠、ph條件、間質(zhì)壓)佳励，腫瘤在TME中就像汽車(chē)與停車(chē)場(chǎng)的關(guān)系休里。

2018年cell文章Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. 介紹了單細(xì)胞測(cè)序在研究乳腺癌微環(huán)境的應(yīng)用，分析了來(lái)自8個(gè)乳腺瘤以及匹配的正常乳腺組織赃承，血液和淋巴結(jié)中的45,000個(gè)免疫細(xì)胞妙黍，做了一個(gè)乳腺癌腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞圖譜。

ECM（extracellular matrix）：細(xì)胞外基質(zhì)瞧剖。是由細(xì)胞合成拭嫁、分泌的生物大分子在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，主要有4大類(lèi)：膠原抓于、非膠原糖蛋白做粤、氨基聚糖與蛋白聚糖、彈性蛋白毡咏。腫瘤中驮宴，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)譜顯著區(qū)別于正常組織。實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程伴隨結(jié)締組織的增生與纖維化呕缭；腫瘤中細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)改變不僅體現(xiàn)在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)水平與相對(duì)組成的改變堵泽，同時(shí)還表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與剛性等物理學(xué)性質(zhì)的改變
參考：細(xì)胞外基質(zhì)與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞

EMT（ epithelial-to-mesenchymal transition）：指的是上皮型細(xì)胞在特定生理?xiàng)l件下向間質(zhì)型細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變修己。惡性腫瘤經(jīng)常伴隨轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程是一個(gè)多因素迎罗、多階段的復(fù)雜過(guò)程睬愤。通常認(rèn)為EMT會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞的E-cadherin、claudin纹安、occludin等連接分子表達(dá)缺失, 破壞細(xì)胞極性尤辱；另外會(huì)促使使一些參與細(xì)胞外
基質(zhì)(主要包括膠原、層黏素和纖維結(jié)合素等)和基底膜降解和破壞的溶解酶如基質(zhì)金屬蛋白酶高表達(dá)厢岂，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織屏障光督。
參考：上皮–間質(zhì)轉(zhuǎn)化: 腫瘤轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控機(jī)制

MMTV-PyMT mouse model： 自發(fā)型腫瘤模型小鼠=》遺傳育種保留下來(lái)的帶有自發(fā)型乳腺癌的動(dòng)物模型，與人類(lèi)的發(fā)生相似塔粒，重復(fù)性公認(rèn)性較好

FACS strategy：即 流式細(xì)胞分選技術(shù)结借。不得不看看單細(xì)胞分離技術(shù)的知識(shí)，單細(xì)胞分離主要依據(jù)單細(xì)胞的表型與生物標(biāo)記物卒茬，來(lái)篩選完整的單個(gè)細(xì)胞船老，主要的分選方法有：有限稀釋法(Limiting Dilution)、顯微操作(Micromanipulator)圃酵、激光顯微切割（LCM）柳畔、流式細(xì)胞分選（FACS）、微流控技術(shù)（Microfluidics）郭赐。
FACS是比較常用的方法薪韩，它可以獲得隨機(jī)樣品，可以利用熒光標(biāo)記的抗體獲得細(xì)胞表面特異marker的細(xì)胞亞群堪置，進(jìn)而探究細(xì)胞亞群躬存。允許將細(xì)胞分選到96或384孔板中進(jìn)行后續(xù)的單細(xì)胞測(cè)序，但是FACS需要較大的細(xì)胞量舀锨，并且會(huì)出現(xiàn)一孔多個(gè)或一孔沒(méi)有細(xì)胞的現(xiàn)象岭洲；
另外，顯微操作可以在特定位置對(duì)少量細(xì)胞進(jìn)行獲取坎匿，但是它耗費(fèi)人力盾剩，高通量受限；微流控可以對(duì)整個(gè)分選過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)替蔬，但是依賴(lài)固定的微流控芯片

Smart-seq2： 提到單細(xì)胞不得不說(shuō)這個(gè)技術(shù)告私，目前它和10X是最主流的建庫(kù)技術(shù)。它的重點(diǎn)是"測(cè)的少承桥，但測(cè)得長(zhǎng)“驻粟。它以單個(gè)細(xì)胞或10pg的RNA為模板，將Oligo(dT) VN Primer作為逆轉(zhuǎn)錄引物凶异，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的模板轉(zhuǎn)換（Template-switching）活性蜀撑，在cDNA的3’端添加一段接頭序列挤巡，通過(guò)該接頭序列進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增，可以獲得全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物酷麦。它對(duì)RNA質(zhì)量要求高矿卑，RNA降解對(duì)引起5’端信息丟失

結(jié)果

揭示小鼠乳腺癌CAFs亞群

采用負(fù)向篩選的FACS去除上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞沃饶、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞母廷，從MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤組織樣本中分選出EpCAM?/CD45?/CD31?/NG2?細(xì)胞類(lèi)群（共構(gòu)建了2個(gè)384孔板細(xì)胞=768個(gè)CAFs文庫(kù)）

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然后smart-seq2測(cè)序，加入ERCC spike-in糊肤，結(jié)果有52個(gè)質(zhì)量不合格琴昆，然后去掉了細(xì)胞中平均表達(dá)量小于1的基因，得到了10835個(gè)內(nèi)源基因和53個(gè)spike-in去做下游分析馆揉。平均每個(gè)細(xì)胞得到4600個(gè)差異基因椎咧，然后進(jìn)行降維，利用DBSCAN進(jìn)行t-SNE分析把介，鑒定了4個(gè)細(xì)胞亞群

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得到亞群然后進(jìn)行功能分析

利用ROTS（reproducibility-optimized test statistic）方法將每個(gè)群體和其他的混合群體對(duì)比尋找差異基因，1-4號(hào)亞群分別得到522蟋座，1999拗踢，590，859個(gè)顯著差異表達(dá)基因(significantly differentially expressed向臀，SDE巢墅，認(rèn)為FDR<0.001)，然后將每個(gè)亞群的前18個(gè)SDEs聚類(lèi)畫(huà)熱圖券膀。

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另外為了檢測(cè)ROTS的準(zhǔn)確性君纫，又用SCDE、edgeR芹彬、DESeq2蓄髓、Wilcoxon rank-sum test方法分析，得到了類(lèi)似的SDEs(見(jiàn)附表4)

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然后利用每個(gè)群體的前150SDEs進(jìn)行GO分析舒帮，4個(gè)CAFs亞群命名為：vCAFs（血管發(fā)育和生成）会喝、eCAFs（細(xì)胞外基質(zhì)）、cCAFs（細(xì)胞周期）和dCAFs（組織發(fā)育）

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細(xì)胞亞群在腫瘤中的時(shí)空分布

目的是確定4種CAFs的來(lái)源和分布玩郊，繪制了SDE的小提琴圖肢执，并結(jié)合免疫熒光、免疫組化等標(biāo)記了亞群的marker基因：vCAFs=》Desmin译红、NID-2预茄、CD31；mCAFs=》PDGFRα侦厚；dCAFs=》SCRG1耻陕、EPCAM

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推測(cè)分布：

• vCAFs起源于血管周細(xì)胞拙徽，隨后向腫瘤基質(zhì)區(qū)域侵襲；
• mCAFs來(lái)源于組織常駐成纖維細(xì)胞淮蜈；
• cCAFs為vCAFs的增殖狀態(tài)斋攀；
• dCAFs來(lái)源于腫瘤細(xì)胞，并發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)化梧田。

后來(lái)還將小鼠CAFs與TGCA中乳腺癌的bulk 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析

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TCGA中的基因與vCAFs淳蔼、mCAFs的SDE相關(guān)性更高

原文鏈接
作者：劉小澤