Integrative multi-omics and drug response profiling of childhood acute lymphoblastic leukemia cell lines
兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系的綜合多組學(xué)和藥物反應(yīng)譜分析
發(fā)表期刊：Nat Commun
發(fā)表日期：2022 Mar 30
DOI:? 10.1038/s41467-022-29224-5
一蒿柳、背景
????????急性淋巴細(xì)胞白血菜鸢帷（ALL）占所有兒童癌癥的30%，是最常見的兒童癌癥。盡管廣泛的化療方案和異體造血干細(xì)胞移植（HSCT）在臨床上取得了成功，但仍有相當(dāng)數(shù)量的患者（15-20%）生存狀況不佳。因此颜矿，彌合ALL治療方案的差距可能需要開發(fā)藥物和細(xì)胞療法洗贰；而這一過(guò)程將取決于對(duì)無(wú)反應(yīng)亞型的生物標(biāo)志物和生物學(xué)特性的深入研究找岖。
????????考慮到轉(zhuǎn)錄后和翻譯后的機(jī)制對(duì)每個(gè)細(xì)胞成分的蛋白質(zhì)水平有不同的影響，其方式由細(xì)胞健康要求決定敛滋，蛋白質(zhì)組代表了理解細(xì)胞表型的理想框架许布。最近的研究表明，癌癥的蛋白質(zhì)組和基因表型之間的相關(guān)性很差绎晃，包括兒童ALL爹脾。
二、材料與方法
1.數(shù)據(jù)來(lái)源
49個(gè)兒童ALL細(xì)胞系和兩個(gè)EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系
2.實(shí)驗(yàn)流程
1）細(xì)胞培養(yǎng)箕昭、質(zhì)譜分析的樣品制備、肽的高分辨等電聚焦(HiRIEF)解阅、HiRIEF餾分的LC-MS/MS運(yùn)行落竹、LC-MS/MS運(yùn)行分析
2）ALL細(xì)胞系的藥物敏感性和耐藥性測(cè)試
3）CETSA分析、西方印跡法货抄、通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞存活率述召、RNA測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組分析、轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的融合分析
4）轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的差異表達(dá)（DE）分析：基于RNA的差異表達(dá)分析是用edgeR進(jìn)行的蟹地；FeatureCounts用于組裝原始計(jì)數(shù)矩陣积暖，edgeR使用該計(jì)數(shù)矩陣來(lái)進(jìn)行基于負(fù)二項(xiàng)分布的差異表達(dá)分析
5）高變異蛋白的鑒定：使用期望最大化方法（EM）來(lái)估計(jì)不同的混合物成分
6）蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的聚類：向聚類程序提交了三個(gè)不同的數(shù)據(jù)集：全部細(xì)胞系、僅B細(xì)胞（BCP-ALL怪与，B-ALL）和僅T細(xì)胞（T-ALL）夺刑；使用R軟件包ConsensusClusterPlus進(jìn)行共識(shí)聚類算法
7）轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的共識(shí)聚類：其方法與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)類似；使用ggalluvial R軟件包中實(shí)現(xiàn)的Sankey圖來(lái)比較RNA和蛋白質(zhì)聚類分别；使用pvclust R包確定近似的自舉概率來(lái)評(píng)估RNA簇的不確定性遍愿。
8）蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的差異豐度分析：使用DEqMS進(jìn)行
9）相關(guān)性分析：使用64個(gè)匹配樣本的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)之間的重疊基因（n = 8981），進(jìn)行每個(gè)基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平之間的相關(guān)性耘斩；對(duì)43個(gè)有DSRT的細(xì)胞系的所有量化的蛋白質(zhì)（n = 12,446）的sDSS和蛋白質(zhì)豐度之間的相關(guān)性分析也使用Pearson Rank Correlation進(jìn)行
10）基因組富集分析：GSEA
11）復(fù)合調(diào)控分析：研究蛋白復(fù)合物的調(diào)控沼填，使用所有細(xì)胞系的mRNA-蛋白相關(guān)性來(lái)計(jì)算CORUM復(fù)合物
12）藥物與蛋白相關(guān)性的UMAP
13）差異相關(guān)分析：使用DGCA軟件包進(jìn)行差異相關(guān)分析81，應(yīng)用于BCP-ALL（B_Lineage）或T-ALL（T_Lineage）中藥物和蛋白質(zhì)的sDSS之間計(jì)算的皮爾遜相關(guān)性
14）流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析：所有的量化都是使用BD FacsDiva軟件（BD Biosciences）進(jìn)行的
三括授、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01 - 兒童ALL細(xì)胞系深入的多組學(xué)分析
????????作者通過(guò)檢查蛋白質(zhì)和RNA水平以及藥物敏感性（圖1a）對(duì)51個(gè)現(xiàn)成的細(xì)胞系進(jìn)行了深入分析坞笙，這些細(xì)胞系代表了具有不同細(xì)胞遺傳背景的29個(gè)B系和22個(gè)T系細(xì)胞系（圖1b）〖孕椋基于液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）對(duì)細(xì)胞系的蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)行定量分析薛夜，并在隨后的分析中鑒定和定量了279351個(gè)多肽，這些肽被分配到13704個(gè)蛋白質(zhì)曲管，來(lái)自12446個(gè)基因（圖1a）却邓。多重化是通過(guò)使用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（TMT）的肽標(biāo)記來(lái)實(shí)現(xiàn)的，在幾個(gè)TMT組中院水，SEM細(xì)胞系的技術(shù)和/或生物重復(fù)被用于分析方法學(xué)的變異性（補(bǔ)充圖1a）腊徙。大多數(shù)細(xì)胞系的生物復(fù)制相隔1年左右简十，每個(gè)細(xì)胞系的所有重復(fù)序列組合在一起（補(bǔ)充圖1b）。使用核糖體耗盡的總RNA對(duì)所有51個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析撬腾，另外還對(duì)15個(gè)具有匹配蛋白質(zhì)組樣品的復(fù)制體進(jìn)行了分析（圖1b）螟蝙，對(duì)43個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行了藥物敏感性和耐藥性測(cè)試（DSRT），使用了528種被批準(zhǔn)的腫瘤藥物以及研究中的藥物（圖1a）民傻。
????????蛋白質(zhì)組圖譜的主成分分析（PCA）分離出四個(gè)主要的細(xì)胞系譜系關(guān)聯(lián)組（圖1c）胰默。在這個(gè)分析中，來(lái)自T系和B系的細(xì)胞系被明確分開漓踢，B系細(xì)胞系被進(jìn)一步區(qū)分為B細(xì)胞前體急性淋巴細(xì)胞白血睬Ｊ稹（BCP-ALL）和B-ALL細(xì)胞系。兩個(gè)細(xì)胞系（CCRF-SB和COG-LL-356h）是愛潑斯坦-巴爾病毒（EBV）轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系喧半，它們組成了第四個(gè)表型組奴迅。為了確定各細(xì)胞系的差異表達(dá)（DE）蛋白，使用差異表達(dá)定量質(zhì)譜法（DEqMS）進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)比較挺据。首先取具，在B細(xì)胞和T細(xì)胞系之間進(jìn)行了定量分析，排除了EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系扁耐，隨后進(jìn)行了基因集富集分析（GSEA）暇检，指出了各系的B細(xì)胞受體或T細(xì)胞受體信號(hào)通路（補(bǔ)充圖1c）。
????????按細(xì)胞遺傳背景分層婉称，數(shù)據(jù)集被證實(shí)反映了已知標(biāo)記物和途徑的富集情況块仆。在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集中，已知作為白血病驅(qū)動(dòng)病變或特征的融合蛋白被富集酿矢，包括TCF3-PBX1融合的PBX1榨乎、ROR1和WNT1626，以及BCR-ABL1瘫筐、NUP214-ABL1和SPFQ-ABL1融合的ABL1（圖1d）蜜暑。其他與特定易位相關(guān)的已知標(biāo)記也可以被檢測(cè)到，包括ETV6-RUNX127,28的IGF2BP1和PIK3C3策肝，以及KMT2A/混合線白血病的MEIS1（圖1d和補(bǔ)充圖1d）肛捍。此外，利用ALL患者樣本的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)選定的亞型進(jìn)行了DE分析之众，并將其與細(xì)胞遺傳亞型匹配的細(xì)胞系中差異豐富的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較拙毫，結(jié)果顯示臨床患者樣本和細(xì)胞系之間有很好的一致性（補(bǔ)充圖1e）。這些結(jié)果表明棺禾，這些細(xì)胞系保留了臨床ALL患者樣本的分子特征缀蹄。
02 - ALL蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)性分析
????????作者對(duì)所有mRNA-蛋白質(zhì)對(duì)（n = 8981）進(jìn)行了Spearman配對(duì)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)的中位數(shù)為0.55（圖2a）。為了評(píng)估在與各自的mRNA定量不同的水平上檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的功能影響缺前，用Spearman相關(guān)系數(shù)排列的列表來(lái)確定最高和最低相關(guān)對(duì)的富集的KEGG途徑蛀醉。高度相關(guān)的mRNA-蛋白對(duì)屬于專門的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如B細(xì)胞和T細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的NFKB1和LCK衅码，而相關(guān)性差的配對(duì)屬于管家功能拯刁，如剪接體和核糖體過(guò)程中的SRSF2和RPL5（圖2b）。
????????作者使用從CORUM獲得的蛋白質(zhì)復(fù)合體成員的數(shù)據(jù)集來(lái)證明逝段，相對(duì)于隨機(jī)對(duì)而言垛玻，在蛋白質(zhì)水平比在轉(zhuǎn)錄本水平，復(fù)合體成分之間發(fā)生更高的成對(duì)相關(guān)性（圖2c）奶躯。與以前的研究一致帚桩，發(fā)現(xiàn)miRNA靶向、亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)降解在塑造復(fù)合體成員的蛋白質(zhì)豐度方面有類似的趨勢(shì)嘹黔，反映了轉(zhuǎn)錄后和翻譯后機(jī)制的累積和互補(bǔ)效應(yīng)朗儒。
????????在上述一般機(jī)制的同時(shí)，作者檢測(cè)到了與突變狀態(tài)和復(fù)合體成員有關(guān)的蛋白質(zhì)-RNA比率的獨(dú)特分子指紋参淹。對(duì)于有GINS2突變（P19S）35的REH細(xì)胞系，GINS-復(fù)合物成員的蛋白-mRNA差異明顯大于其他細(xì)胞系中相應(yīng)的蛋白-mRNA對(duì)的差異乏悄。這表明該突變可能對(duì)整個(gè)蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)或功能產(chǎn)生影響浙值，而這種影響只在蛋白質(zhì)組水平上表現(xiàn)出來(lái)。數(shù)據(jù)暗示了復(fù)合物形成的潛在障礙檩小，這將導(dǎo)致其他GINS成員的附帶降解（圖2d）开呐。
????????考慮到經(jīng)常參與ALL啟動(dòng)和進(jìn)展的標(biāo)志物，MTOR规求、AKT2和KMT2D顯示出較差的mRNA-蛋白質(zhì)相關(guān)性筐付，而TP53沒(méi)有顯示出相關(guān)性（圖2e）。這與之前的觀察結(jié)果一致阻肿，即KMT2D截?cái)嗤蛔冇绊懙鞍踪|(zhì)水平瓦戚，但不影響轉(zhuǎn)錄本水平。來(lái)自B細(xì)胞和T細(xì)胞受體KEGG途徑的標(biāo)志物顯示了類似的模式丛塌，mRNA-蛋白質(zhì)的相關(guān)范圍很廣较解。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了轉(zhuǎn)錄物水平分析允許對(duì)標(biāo)記物的蛋白水平豐度進(jìn)行不精確的解釋。
03 - 蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組概況的表型和聚類分析
????????使用高變異蛋白質(zhì)（n = 3282）對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行共識(shí)聚類赴邻，表明有七個(gè)不同的聚類印衔。包括所有樣品和蛋白質(zhì)的層次聚類將細(xì)胞系分層為共識(shí)白血病集群（CLC）（圖3a，補(bǔ)充圖3a-c）姥敛。CLC1包含有ETV6-RUNX1奸焙、BCR-ABL1、KMT2A-MLLT1和IGH-MYC基因融合的細(xì)胞系。CLC2主要由TCF3重排的ALL細(xì)胞系（TCF3- PBX和TCF3-HLF）以及幾個(gè)具有以前未指定的細(xì)胞遺傳背景的細(xì)胞系組成与帆。CLC3包含22個(gè)T-ALL細(xì)胞系中的16個(gè)了赌，同樣具有不同的細(xì)胞遺傳背景，與聚集在CLC7中的其他6個(gè)T-ALL細(xì)胞系相比鲤桥，其特點(diǎn)是G2M檢查點(diǎn)標(biāo)志揍拆、較高的剪接體和較高的E2F靶點(diǎn)活性。
????????鑒于共轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制與剪接體的組裝和降解有關(guān)茶凳，作者對(duì)CLC3和CLC7之間的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了DE分析嫂拴，然后進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果未能再現(xiàn)剪接體的上調(diào)（圖3b）贮喧。改變剪接圖譜和不同的剪接已經(jīng)牽涉到藥物和治療的抗性和ALL39-41筒狠，這些結(jié)果為使用蛋白質(zhì)組來(lái)量化ALL的關(guān)鍵標(biāo)志物的價(jià)值提供了進(jìn)一步的支持。
????????為了更好地了解兩個(gè)不同譜系之間的相對(duì)差異箱沦，對(duì)每個(gè)譜系單獨(dú)進(jìn)行了聚類辩恼。這確定了B系（B-CLC）的五個(gè)聚類和T系（T-CLC）細(xì)胞系的七個(gè)聚類（圖3c）。此外谓形，對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了共識(shí)聚類灶伊，將B系和T系分別細(xì)分為六個(gè)和五個(gè)不同的亞群（圖3d）。其中三個(gè)具有KMT2A重排亞型的細(xì)胞系被歸入RNA簇4寒跳，一個(gè)被歸入RNA簇1聘萨，而蛋白質(zhì)組學(xué)聚類將這些細(xì)胞系分為三個(gè)不同的蛋白質(zhì)組簇（B-CLC1、B-CLC3和B-CLC5）童太，表明蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了一個(gè)額外角度來(lái)揭示表型差異米辐，這可能具有臨床意義。在兩種KMT2A重排亞型之間進(jìn)行了DEqMS分析书释，并在KMT2A-AFF1細(xì)胞系中確定了p53是上調(diào)最多的蛋白質(zhì)（圖3e）翘贮，表明KMT2A重排細(xì)胞系之間的p53調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)存在差異。此外爆惧，兩個(gè)ETV6-RUNX1細(xì)胞系被歸入同一個(gè)RNA簇（簇3）狸页，但被歸入不同的蛋白質(zhì)組簇（B-LC2和B-LC5）。
????????為了評(píng)估細(xì)胞系的系譜狀態(tài)扯再，使用已建立的B細(xì)胞和T細(xì)胞發(fā)育階段的細(xì)胞標(biāo)志物對(duì)BCP-ALL和T-ALL細(xì)胞系進(jìn)行免疫分型（補(bǔ)充圖3d）肴捉。對(duì)于T-ALL細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)雙陰性（DN）和雙陽(yáng)性（DP）的分化階段被專門分開在不同的集群中叔收。在T-ALL集群中齿穗，T-CLC1、T-CLC2和T-CLC3是由皮質(zhì)DP細(xì)胞系或免疫分型不明確的細(xì)胞系組成饺律，而T-CLC5窃页、T-CLC6和T-CLC7包含DN前體細(xì)胞系（補(bǔ)充圖3e，f）。盡管TAL1和LYL1是用于臨床T-ALL分層的主要亞型標(biāo)記脖卖，但相對(duì)于其他DN或DP細(xì)胞系乒省，具有這些標(biāo)記的細(xì)胞系在我們的聚類中沒(méi)有表型上的區(qū)別。
????????在B細(xì)胞狀態(tài)的分配中畦木，一些細(xì)胞遺傳學(xué)亞型似乎局限于一種B細(xì)胞狀態(tài)袖扛，而其他的則占據(jù)了多種細(xì)胞狀態(tài)和蛋白質(zhì)組群（補(bǔ)充圖3g，h）十籍。TCF3-PBX1和MEF2D-HNRNPUL1細(xì)胞系被確定為統(tǒng)一的B細(xì)胞狀態(tài)分配蛆封，所有的樣本分別被歸類為前B型或早期前B型，這表明這些融合可能與一個(gè)停滯的細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)勾栗。B-CLC2和B-CLC3是由顯示前B或前B系特征的細(xì)胞系定義的惨篱，而且還顯示了維持B系的轉(zhuǎn)錄因子PAX5的高相對(duì)豐度。相反围俘，B-CLC1和B-CLC5似乎沒(méi)有共同的系譜表型砸讳。然而，B-CLC1表現(xiàn)出FLT3的明顯富集界牡，F(xiàn)LT3是一種對(duì)臨床結(jié)果有致病作用的造血特征簿寂，通常與兒童ALL45的白血病驅(qū)動(dòng)突變有關(guān)。B-CLC5含有這種蛋白最豐富的細(xì)胞系（COG-LL-355h宿亡，380陶耍，MHH-CALL-4）。此外她混，B-CLC5的特點(diǎn)是粘附分子CEACAM1的豐度，它通過(guò)與TIM347的相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受性的免疫環(huán)境泊碑，表明對(duì)致癌免疫調(diào)節(jié)有共同的保留親和力坤按。
04 - 兒童ALL細(xì)胞系對(duì)一組528種腫瘤藥物的藥物敏感性
????????作者對(duì)43個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行了DSRT，針對(duì)528種FDA批準(zhǔn)的和正在研究的腫瘤藥物馒过，在5個(gè)濃度下進(jìn)行研究臭脓。選擇性藥物敏感性評(píng)分（sDSS）是通過(guò)將藥物敏感性與正常骨髓（BM）49的藥物反應(yīng)正常化而得到的（圖4a）腹忽。
????????廣譜細(xì)胞毒藥物来累，如常規(guī)化療藥物在大多數(shù)測(cè)試的細(xì)胞系中表現(xiàn)出高活性（圖4b）。許多激酶抑制劑（也在大多數(shù)測(cè)試的細(xì)胞系中表現(xiàn)出高活性窘奏，而不論細(xì)胞遺傳亞型或血統(tǒng)如何嘹锁。許多細(xì)胞系對(duì)p53-MDM2拮抗劑都很敏感，只有一組細(xì)胞系對(duì)這些拮抗劑一直有抵抗力着裹，其中KMT2A-AFF1細(xì)胞系（ALL-PO和SEM）懷疑p53通路失調(diào)领猾，可能是由于TP53的突變或其他基因融合導(dǎo)致的調(diào)節(jié)障礙。
????????大多數(shù)細(xì)胞系對(duì)地塞米松、潑尼松龍和甲基潑尼松龍表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)拿舾行运じ停?2個(gè)細(xì)胞系除外面粮，其中REH和JURKAT細(xì)胞系，它們以前被證明對(duì)地塞米松有抗性继低。對(duì)GCs的敏感性與糖皮質(zhì)激素受體（NR3C1）的蛋白豐度有很好的相關(guān)性（圖4c）熬苍，與患者對(duì)GCs的有利反應(yīng)和ALL和骨髓瘤中NR3C1的基礎(chǔ)表達(dá)水平之間的關(guān)系一致。
????????作者使用每種藥物的假定藥物靶點(diǎn)蛋白列表袁翁，對(duì)每種藥物及其假定藥物靶點(diǎn)的藥物敏感性-蛋白豐度的皮爾遜相關(guān)性進(jìn)行排序柴底，以檢查靶點(diǎn)豐度和藥物反應(yīng)之間的關(guān)系（圖4d）。在該分析中排名較高的藥物中梦裂，幾個(gè)酪氨酸激酶抑制劑和受體酪氨酸激酶抑制劑分別與它們的假定靶點(diǎn)ABL1和FLT3的蛋白豐度有良好的相關(guān)性（圖4d）似枕。此外，PARP1抑制劑與PARP1水平很相關(guān)（圖4d）年柠。MDM2抑制劑與MDM2豐度呈正相關(guān)凿歼，而與MDM2降解的目標(biāo)p53呈反相關(guān)（圖4d）。
????????他克莫司是一種大環(huán)內(nèi)酯冗恨，對(duì)12個(gè)ALL細(xì)胞系有效答憔。盡管FKBP1A在這種作用機(jī)制（MoA）中起著關(guān)鍵作用，但發(fā)現(xiàn)FKBP1A的豐度與他克莫司的敏感性呈負(fù)相關(guān)掀抹。然而虐拓，順?lè)词礁滨．悩?gòu)酶家族的另一個(gè)成員FKBP10與他克莫司的敏感性密切相關(guān)（圖4e）。這種意外的相關(guān)性表明傲武，F(xiàn)KBP10值得進(jìn)一步研究它與他克莫司的結(jié)合和活性情況蓉驹。
05 - 兒童ALL細(xì)胞系中的藥物活性機(jī)制
????????作者用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了成對(duì)的藥物敏感性相關(guān)分析，使用至少兩個(gè)細(xì)胞系（n = 281）中sDSS≥8的藥物進(jìn)行分析揪利。累積起來(lái)态兴，相對(duì)蛋白質(zhì)豐度與sDSS的相關(guān)性明顯高于蛋白質(zhì)編碼的mRNA水平（補(bǔ)充圖5a）。
????????對(duì)于每種藥物疟位，至少對(duì)兩個(gè)細(xì)胞系有效（sDSS>8）瞻润，與藥物敏感性相關(guān)的蛋白質(zhì)的皮爾遜相關(guān)值矩陣被用作輸入，使用UMAP進(jìn)行降維甜刻。(圖5a）绍撞。注意到在UMAP空間中，許多藥物靶點(diǎn)家族得院，如ABL1傻铣、HDAC、BCL2和PI3K抑制劑有密切的聯(lián)系（圖5b）祥绞。對(duì)于這些藥物類別矾柜，檢查了與同類藥物分散的異常值阱驾，注意到選擇性I類HDAC抑制劑tacedinaline與其他I類HDAC靶向藥物嚴(yán)重分散。此外怪蔑，TCF3- PBX1融合細(xì)胞系對(duì)tacedinaline表現(xiàn)出抗性里覆，盡管對(duì)大多數(shù)其他HDAC抑制劑有反應(yīng)（圖5c）。
????????為了研究tacedinaline的吸收和細(xì)胞內(nèi)濃度是否在敏感和耐藥的細(xì)胞系中有所不同缆瓣，調(diào)查了tacedinaline與HDAC1的細(xì)胞內(nèi)靶向接觸喧枷。使用細(xì)胞系KOPN-8（KMT2A-MLLT1，對(duì)tacedinaline敏感）和RCH-ACV（TCF3-PBX1弓坞，對(duì)HDACi敏感隧甚，對(duì)tacedinaline耐藥），用細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移試驗(yàn)（CETSA）監(jiān)測(cè)HDAC1的參與情況渡冻。在敏感和耐藥的細(xì)胞中戚扳，tacedinaline處理使HDAC1熱穩(wěn)定的程度相似（約4℃），而且tacedinaline在一定濃度范圍內(nèi)具有同等的目標(biāo)參與（圖5d）族吻。這些觀察結(jié)果表明帽借，盡管有效的靶向參與，但tacedinaline與同類的其他抑制劑不同超歌，它在那些對(duì)HDAC抑制敏感的細(xì)胞系中賦予了抗性砍艾。
????????在UMAP空間中也可以看到具有不同擬議分子靶點(diǎn)的藥物的密切關(guān)聯(lián)，作者通過(guò)檢查sDSS之間的相關(guān)性證實(shí)了這些藥物-藥物關(guān)聯(lián)巍举。對(duì)ERBB2抑制劑mubritinib的敏感性與HIF1A抑制劑BAY-87-2243和VCP/p97抑制劑NMS-873相關(guān)（圖5b）脆荷。這些藥物有一個(gè)共同的替代分子靶點(diǎn)，即呼吸道復(fù)合物I68-70懊悯。此外蜓谋，發(fā)現(xiàn)對(duì)這些藥物的敏感性和蛋白酶體亞單位的豐度之間存在強(qiáng)烈的正相關(guān)關(guān)系（補(bǔ)充圖5b，c）炭分，表明消耗ATP的高蛋白周轉(zhuǎn)率是一個(gè)與敏感性相關(guān)的共同分子特征桃焕。
????????在本研究數(shù)據(jù)集中，大多數(shù)細(xì)胞系對(duì)廣義的BCL2家族成員抑制劑非常敏感（補(bǔ)充圖5d欠窒，e），但對(duì)于BCL家族成員的選擇性抑制劑退子，BCP-ALL和T-ALL細(xì)胞系根據(jù)其敏感性特征進(jìn)行了區(qū)分岖妄。BCP-ALL細(xì)胞系對(duì)選擇性BCL2抑制劑venetoclax非常敏感，而T-ALL細(xì)胞系則對(duì)BCL2L1選擇性抑制劑A-1155463和A-1331852敏感（圖5e）寂祥。venetoclax和A-1155463的敏感性分別與它們的靶蛋白BCL2和BCL2L1的豐度很相關(guān)荐虐，而不完全與世系有關(guān)（圖5f）。
????????競(jìng)爭(zhēng)性PDPK1抑制劑和OSU-03012（AR-12）是另一種具有系別特異性的靶向藥物（圖5e）丸凭，結(jié)果表明在大多數(shù)T-ALL細(xì)胞系和BCP-ALL細(xì)胞系的一個(gè)亞群中具有很好的敏感性福扬。在T-ALL細(xì)胞系中腕铸，OSU-03012敏感性的最佳相關(guān)蛋白是IL9R，然而在BCP-ALL細(xì)胞系中铛碑，IL9R與敏感性不相關(guān)狠裹，敏感性與PDPK1蛋白豐度明顯負(fù)相關(guān)。此外汽烦，STRING網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有PDPK1相互作用的蛋白與BCP-ALL的藥物活性相關(guān)（圖5g）涛菠，對(duì)于相關(guān)的PDPK1途徑的標(biāo)記物，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系撇吞。本研究數(shù)據(jù)集在BCP-ALL中發(fā)現(xiàn)了與HSP90（HSP90AB1俗冻，圖5h）的明顯相關(guān)性。此外牍颈，在最高度相關(guān)的蛋白質(zhì)中迄薄，有許多含有伴侶素的TCP1復(fù)合物（CCT復(fù)合物）的成分（圖5h），該復(fù)合物執(zhí)行ATP依賴性的多肽鏈折疊煮岁。通過(guò)對(duì)該復(fù)合物的功能干擾而產(chǎn)生的藥物活性也與以前描述藥物治療后誘導(dǎo)ER應(yīng)激的數(shù)據(jù)相一致讥蔽，這些關(guān)聯(lián)表明CCT復(fù)合物也可以作為OSU-03012的一個(gè)潛在目標(biāo)被進(jìn)一步研究。此外人乓，通過(guò)藥物相關(guān)性評(píng)估勤篮，OSU-03012與ATP-類似物HSP70家族抑制劑VER-155008在BCP-ALL細(xì)胞系中存在相關(guān)性，但在T-ALL細(xì)胞系中沒(méi)有相關(guān)性色罚。這進(jìn)一步表明碰缔，OSU-03012的敏感性與BCP-ALL細(xì)胞系中對(duì)伴侶蛋白的依賴有關(guān)。
????????為了進(jìn)一步量化與血統(tǒng)有關(guān)的差異戳护，作者使用了差異相關(guān)分析（DCA）金抡，應(yīng)用于BCP-ALL或T-ALL細(xì)胞系的sDSS-蛋白豐度相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白TXNDC9的豐度與許多臨床相關(guān)的化療藥物和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑腌且，包括拉替曲塞梗肝、吉西他濱和SN-38呈相反的方向明顯相關(guān)（補(bǔ)充圖5f）。對(duì)于BCP-ALLs铺董，該蛋白的豐度增加與敏感性相關(guān)巫击，但對(duì)于T-ALLs，該蛋白的豐度與抗性明顯相關(guān)（補(bǔ)充圖5g）精续。眾所周知坝锰，硫氧還蛋白在調(diào)節(jié)蛋白酶體和氧化還原代謝方面發(fā)揮著不同的功能，因此進(jìn)一步探索和表征TXNDC9的相互作用物可以揭示出與血統(tǒng)相關(guān)的生物學(xué)差異重付。TXNDC9的一個(gè)公認(rèn)的結(jié)合伙伴是CCT-復(fù)合物顷级，在BCP-ALL細(xì)胞系中，TXNDC9的豐度與所有CCT-復(fù)合物成員的豐度明顯相關(guān)确垫，但在T-ALL細(xì)胞系中則不然弓颈。這表明TXNCD9和CCT-復(fù)合物之間的相互作用更可能發(fā)生在BCP-ALLs中帽芽，其中TXNDC9的豐度與化療敏感性而不是化療抗性相關(guān)。
06 - MEF2D重新排列的細(xì)胞系的表型特征和藥物敏感性
????????在對(duì)細(xì)胞遺傳亞型翔冀、蛋白質(zhì)組聚類导街、藥物敏感性和細(xì)胞狀態(tài)的分析中，觀察到一組由MEF2D-HNRNPUL1融合基因區(qū)分的細(xì)胞系之間存在驚人的相似性橘蜜。在兒童ALL的情況下菊匿，MEF2D已被發(fā)現(xiàn)與至少六個(gè)不同的融合伙伴融合。MEF2D重排的細(xì)胞遺傳亞型與相對(duì)較差的臨床結(jié)果有關(guān)计福。
????????MEF2D重組的白血病顯示出獨(dú)特的基因表達(dá)特征跌捆，與MEF2D-HNRNPUL1細(xì)胞系中不同含量的蛋白質(zhì)有很大的重疊和一致（圖6a，補(bǔ)充圖6a）象颖。從表型上看佩厚，當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析時(shí)，這些細(xì)胞系聚集在一起说订，細(xì)胞狀態(tài)評(píng)估將它們統(tǒng)一定為早期前B細(xì)胞（補(bǔ)充圖6c）抄瓦。DEqMS分析發(fā)現(xiàn)，與其他BCP-ALL細(xì)胞系相比陶冷，MEF2C和HDAC9屬于差異豐度最高的蛋白質(zhì)（圖6b钙姊，補(bǔ)充圖6b），表明它們可能也對(duì)廣義的I類HDAC抑制劑敏感埂伦。然而煞额，發(fā)現(xiàn)與其他BCP-ALL細(xì)胞系相比，其敏感性沒(méi)有明顯差異（補(bǔ)充圖6d）沾谜。為了進(jìn)一步研究這個(gè)問(wèn)題膊毁，使用了TMP269，一種強(qiáng)效的IIa類HDAC抑制劑基跑，對(duì)HDAC991的IC50為23 nM婚温，發(fā)現(xiàn)在任何測(cè)試的細(xì)胞系中都沒(méi)有抑制作用（補(bǔ)充圖6d）。這表明HDAC9可能不是一個(gè)可治療的弱點(diǎn)媳否，至少在攜帶MEF2D-HNRNPUL1融合體的患者中是白血病細(xì)胞內(nèi)在的毒性栅螟。
????????與它們對(duì)HDAC抑制劑缺乏特異性敏感性相反，相對(duì)于其他BCP-ALL細(xì)胞系篱竭，三個(gè)帶有MEF2D-HNRNPUL1融合體的兒童ALL細(xì)胞系表現(xiàn)出對(duì) Bryostatin-1獨(dú)特的強(qiáng)大和特異性敏感性（圖6c）力图。成年MEF2D-HNRPUL1融合細(xì)胞系KASUMI-7的DSRT分析也顯示出對(duì)Bryostatin-1的明顯敏感性。通過(guò)評(píng)估與sDSS高度相關(guān)的蛋白質(zhì)組標(biāo)志物室抽，觀察到bryostatin-1的毒性與MEF2D-HNRNPUL1細(xì)胞系中上調(diào)的標(biāo)志物之間存在強(qiáng)烈的相關(guān)性（圖6d）搪哪。
????????其中一個(gè)正相關(guān)的標(biāo)志物是RASGRP1靡努，它已被確定為前B細(xì)胞對(duì)負(fù)選擇敏感性的直接媒介坪圾。作為在早期前B細(xì)胞階段表達(dá)了前B細(xì)胞受體的細(xì)胞晓折，本研究MEF2D融合細(xì)胞系處于一個(gè)發(fā)展階段，可能使它們?nèi)菀资艿截?fù)選擇的影響兽泄。為了支持對(duì)這種負(fù)選擇途徑的潛在操縱漓概，觀察到MEF2D融合細(xì)胞具有豐富的DAG降解酶DGKH（圖6b）。
????????作者評(píng)估了ryostatin-1作為一種DAG類似物病梢，是否通過(guò)激活這種促凋亡ERK信號(hào)來(lái)發(fā)揮作用胃珍。在100nM bryostatin-1處理2小時(shí)后，觀察到與DMSO處理的對(duì)照組相比蜓陌，磷酸化的ERK的豐度明顯增加（圖6e）觅彰。
????????為了驗(yàn)證bryostatin-1作為DAG類似物的靶向作用，評(píng)估了MEF2D-HNRPUL1細(xì)胞系是否對(duì)另一種DAG類似物--乙酸山梨醇酯（PMA）敏感钮热。PMA在MEF2D-HNRNPUL1細(xì)胞系中也賦予了強(qiáng)大的毒性（圖6f）填抬，這種影響在MEF2D-HNRNPUL1細(xì)胞系中明顯比其他測(cè)試的BCP-ALL細(xì)胞系更強(qiáng)，這表明Bryostatin-1的目標(biāo)效應(yīng)被PMA復(fù)制了隧期。為了進(jìn)一步確認(rèn)ERK信號(hào)是毒性的媒介飒责，通過(guò)使用MEK抑制劑tramatenib、UO126仆潮、selumetinib和ERK抑制劑ERK 11e阻斷ERK途徑（磷酸化）宏蛉。在用100nM bryostatin-1或25nM PMA處理的細(xì)胞中，同時(shí)用1uM的MEK或ERK抑制劑性置，所有測(cè)試的抑制劑都能顯著提高存活細(xì)胞數(shù)（圖6g和補(bǔ)充圖6e）拾并。除UO126外，單獨(dú)用1uM MEK或ERK抑制劑處理蚌讼，導(dǎo)致MEF2D-HNRPUL1融合細(xì)胞系的存活率輕微但明顯下降辟灰，進(jìn)一步支持針對(duì)ERK磷酸化的藥物在糾正DAG類似物毒性方面特別有利于存活率（補(bǔ)充圖6f）。
四篡石、結(jié)論
????????作者對(duì)49個(gè)兒童ALL細(xì)胞系進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)指導(dǎo)下的分析芥喇，產(chǎn)生了全面的生物標(biāo)志物和藥物敏感性資源，并確定了針對(duì)MEF2D-HNRNPUL1重排的高風(fēng)險(xiǎn)亞群的潛在治療漏洞凰萨。還提供了一個(gè)用戶友好的網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用继控，用于探索本研究中描述的蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和藥物敏感性數(shù)據(jù)胖眷。
