帶數(shù)據(jù)和代碼

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Longitudinal Multi-omics Analyses Identify Responses of Megakaryocytes, Erythroid Cells, and Plasmablasts as Hallmarks of Severe COVID-19

影響因子： 22.553PMID：33296687

期刊年卷：<u>Immunity</u> 2020 12 15;53(6) <u><u>醫(yī)學(xué)一區(qū) 免疫學(xué) Q1 4/155</u></u>

DOI：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.11.017

思路

這篇文章主要是單細(xì)胞組學(xué)與其他組學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用探索COVID-19患者細(xì)胞特征的全面縱向視圖的免疫狀態(tài)墙牌。

1. 使用14名患者的兩中心隊(duì)列進(jìn)行了縱向多組學(xué)研究柑晒，分析了從最多5個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的外周血樣本的整體轉(zhuǎn)錄組固耘，整體DNA甲基化組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（> 358,000個(gè)細(xì)胞，包括BCR譜）镇辉。
2. 在兩個(gè)獨(dú)立的COVID-19患者隊(duì)列中進(jìn)行了驗(yàn)證屡穗。SARS-CoV2感染引起血液循環(huán)細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，重癥的COVID-19的特征是增殖性代謝活躍的漿母細(xì)胞增加忽肛。
3. 與重癥疾病同時(shí)發(fā)生村砂，作者還發(fā)現(xiàn)了干擾素激活的循環(huán)巨核細(xì)胞的擴(kuò)增和紅細(xì)胞生成增加，****并具有缺氧信號(hào)傳導(dǎo)的特征屹逛。
4. 巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞衍生的共表達(dá)模塊可預(yù)測(cè)致命疾病的預(yù)后础废，細(xì)胞類型特異性表達(dá)基因與致命的COVID-19結(jié)果相關(guān)。
5. 這項(xiàng)研究證明了SARS-CoV-2感染具有廣泛的細(xì)胞作用罕模，并為開發(fā)COVID-19患者的生物標(biāo)志物和靶向治療提供了切入點(diǎn)色迂。

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重癥COVID-19與機(jī)能障礙的免疫反應(yīng)有關(guān)

1. 重癥COVID-19患者的血漿中多種細(xì)胞因子和趨化因子的血漿含量更高（Chen等，2020 ; Giamarellos-Bourboulis等手销，2020 ; Huang等歇僧，2020 ; Ong等，2020）重癥的情況锋拖。重癥COVID-19的患者表現(xiàn)出I型干擾素（IFN）應(yīng)答受損诈悍，IFN生成低以及IFN刺激基因的異質(zhì)調(diào)節(jié)（Blanco-Melo等，2020 ; Hadjadj等兽埃，2020）侥钳。

2. 患有重癥COVID-19的患者的外周血表現(xiàn)出分泌白介素6（IL-6）的CD14 ^hi CD16 ^hi單核細(xì)胞的高頻率以及非經(jīng)典（CD14 ^lo CD16 ^hi）單核細(xì)胞的減少（Hadjadj等， 2020 ; Schulte-Schrepping等柄错，2020）舷夺。

3. 高炎癥性COVID-19與增生的I-IFN激活的CD14 ⁺ HLA ^lo抑制性單核細(xì)胞的出現(xiàn)和中性粒細(xì)胞前期計(jì)數(shù)升高的緊急粒細(xì)胞生成有關(guān)。T細(xì)胞淋巴細(xì)胞減少和耗竭也被認(rèn)為是重癥COVID-19的標(biāo)志（Diao等售貌，2020 ; Giamarellos-Bourboulis等给猾，2020; Guan et al。颂跨，2020 ; Huang等敢伸，2020 ; Zheng等，2020）恒削。

4. SARS-CoV-2感染可引起特定的T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)（Braun等人池颈，2020年尾序；Grifoni等人，2020年躯砰；Long等人每币，2020年；Ni等人琢歇，2020年）兰怠。免疫細(xì)胞群和功能的這些變化與疾病結(jié)果持久免疫的關(guān)系如何是積極研究的領(lǐng)域。

5. 肺栓塞和血栓形成是重癥COVID-19病例的常見(jiàn)臨床特征（Deshpande矿微，2020）痕慢，盡管有足夠的抗凝治療尚揣。肺泡毛細(xì)血管血栓在COVID-19中的流行度是流感尸檢中的9倍（Lax等涌矢，2020）】炱患者表現(xiàn)出升高的D-二聚體水平和廣泛的血栓形成性微血管損傷（De Voeght等娜庇，2020；Rapkiewicz等方篮，2020）名秀。多項(xiàng)研究表明，血小板免疫細(xì)胞相互作用發(fā)生了改變（Leppkes等藕溅，2020匕得；Manne等，2020）巾表，并且受影響的肺中存在巨核細(xì)胞（MK）（Meyerholz和McCray汁掠，2020年）。

結(jié)果

1. 研究設(shè)計(jì)

14個(gè)住院的COVID-19患者的5個(gè)外周血樣本集币，作者采用了scRNA-seq（10x Genomics）考阱，單細(xì)胞B細(xì)胞受體（BCR），RNA-seq鞠苟、DNA甲基化分析和多重細(xì)胞因子ELISA分析（圖1A）乞榨。作者使用了經(jīng)過(guò)修改的WHO序數(shù)量表（WHO，2020年）当娱，該量表還考慮了幾種炎癥標(biāo)志物（血清C反應(yīng)蛋白[CRP]吃既，血清IL-6和鐵蛋白）（表S2）, 該分?jǐn)?shù)用于對(duì)患者的病程進(jìn)行分類（圖1B和1C）。

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圖1用于疾病軌跡分析的疾病階段的臨床定義

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圖S1

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圖S2

2. scRNA-seq分析可確定沿COVID-19疾病軌跡的細(xì)胞變化

1. 358,930個(gè)細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)跨细，每個(gè)樣品平均有10,900個(gè)細(xì)胞（圖2 A）态秧。
2. 每位患者最多分析四個(gè)樣品。UMAP用于可視化細(xì)胞種群的結(jié)構(gòu)（圖2 B–2E）扼鞋。
3. 基于圖的聚類確定了數(shù)據(jù)集中的37個(gè)不同的細(xì)胞簇（圖S1 A）申鱼。根據(jù)每個(gè)簇的基因基因進(jìn)行細(xì)胞類型分類愤诱，并使用參考轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行確認(rèn)（Aran等，2019 ; Wilk等捐友，2020 ; Zheng等淫半，2017）（圖2 B，2C匣砖，S1B和S1C）科吭。
4. 單個(gè)患者的細(xì)胞均勻分布在UMAP表示中，但單核細(xì)胞亞群中個(gè)體間的異質(zhì)性較高（圖2 D猴鲫，2E和S2）对人。
5. 跨時(shí)間點(diǎn)的計(jì)數(shù)揭示了幾種細(xì)胞類型的變化，包括單核細(xì)胞拂共，增生性淋巴細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞（圖2 E牺弄，2F和S1 D）。
6. 作者觀察到經(jīng)典CD14 ⁺單核細(xì)胞的增加宜狐，尤其是在恢復(fù)期势告，而非經(jīng)典CD16 ⁺單核細(xì)胞的數(shù)量在擬時(shí)序2和3都增加了（圖S2）。
7. 此外抚恒，作者確認(rèn)了在關(guān)鍵階段（擬時(shí)序2）抑制了人類白細(xì)胞抗原-DR（HLA-DR）的表達(dá)（Schulte-Schrepping等人咱台，2020年）。存在CD4 ⁺細(xì)胞的淋巴細(xì)胞減少俭驮，但不如其他數(shù)據(jù)集中明顯回溺。
8. 作者還注意到，從增生階段到早期恢復(fù)期混萝，成漿細(xì)胞（PB）的比例增加遗遵，而B細(xì)胞在增生階段和復(fù)雜階段卻被消耗掉了（Wilk et al 2020）。值得注意的是譬圣，作者認(rèn)識(shí)到COVID-19患者外周血中幾種源自骨髓的前體細(xì)胞類型的存在增加瓮恭。
9. 在整個(gè)疾病過(guò)程中，MK比例明顯升高（圖2F）厘熟。
10. 為了定義可能直接被SARS-CoV-2感染的潛在細(xì)胞群屯蹦，作者專門詢問(wèn)了數(shù)據(jù)集中的ACE2 mRNA量，該量在所有細(xì)胞群中均低于檢測(cè)極限（<7個(gè)讀數(shù))绳姨。
11. 相對(duì)細(xì)胞比例與臨床活性參數(shù)和多重血清ELISA的相關(guān)性分析表明登澜，PB比例與血清壞死因子（TNF），IL-10和IL-21（B細(xì)胞關(guān)鍵參與因子）的血清量相關(guān)飘庄。通過(guò)STAT3和BLIMP-1（也稱為PRDM1）分化為PB（Ozaki等脑蠕，2004）。
12. 骨髓前體細(xì)胞增加與IL-33的含量增加有關(guān)，IL-33是參與調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞再生的Th2細(xì)胞因子（Kim等人谴仙，2014年）迂求，MK升高與炎性參數(shù)升高有關(guān)，例如血清CRP晃跺，IL -6和IFN-α（圖2 G）揩局。

在細(xì)胞簇之間表現(xiàn)出0.25倍的差異。根據(jù)標(biāo)記基因鑒定了感興趣的簇（圖S1 C）掀虎；

單核細(xì)胞（CD14凌盯，ITGAM， S100A8和A100A9）烹玉，

粒細(xì)胞（FCGR3B）驰怎，

類紅細(xì)胞（HBA1，HBA2和HBB）二打，

NK細(xì)胞（GNLY县忌，NCAM1），

增殖淋巴細(xì)胞（MKI67和TUBA1B）址儒，

CD4 ⁺ T細(xì)胞（CD3G芹枷，CD4和CCR7）衅疙，

CD8 ⁺T細(xì)胞（CD3G和CD8A）莲趣，

樹突狀細(xì)胞（PLD4，IL3RA和LILRA4）饱溢，

B細(xì)胞（CD19）喧伞，

漿母細(xì)胞（CD27，CD38和MZB1）绩郎，

巨核細(xì)胞（ITGA2B潘鲫，TUBB1和GP9）和前體細(xì)胞（CD34，ITGA4和TUBA1A））肋杖，

例如造血干細(xì)胞（HSC）溉仑，巨核細(xì)胞-紅系祖細(xì)胞（MEP），常見(jiàn)髓樣祖細(xì)胞（CMP）和

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞（GMP）状植。

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圖2沿COVID-19疾病軌跡的細(xì)胞變化

（A）原理圖工作流程浊竟。

（B）所有合并樣本的細(xì)胞類型UMAP表示。通過(guò)簇基因基因鑒定了十二種細(xì)胞類型津畸≌穸ǎ總共描繪了358,930個(gè)細(xì)胞。

（C）細(xì)胞類型特異性特征基因的點(diǎn)圖肉拓。根據(jù)十個(gè)最具特征的基因的表達(dá)量選擇基因后频。顏色區(qū)分具有增加的（紅色）表達(dá)或減少的（藍(lán)色）表達(dá)的基因，點(diǎn)大小代表每組表達(dá)相應(yīng)基因的細(xì)胞數(shù)。

（D）所有合并樣本的原始UMAP樣本表示卑惜。樣品使細(xì)胞著色膏执。樣本命名基于患者ID（001-014）和樣本采集時(shí)間的第1天（入院后TA），第3天（TA2）露久，第8天（TB）胧后，第11天（TB2），第14天（TC）抱环，和第20天（TE）壳快。

（E）所有合并樣本的偽時(shí)UMAP表示，用偽時(shí)上色镇草。

（F）按擬時(shí)序分組的單元比例眶痰。表示為點(diǎn)的細(xì)胞比例是指基于單個(gè)樣品的總細(xì)胞數(shù)的百分比，水平線表示平均值梯啤。擬時(shí)序由顏色表示竖伯。p值基于縱向線性混合模型，用于COVID-19擬時(shí)序的比較因宇，p值基于Mann-Whitney檢驗(yàn)七婴，用于健康與COVID-19樣本之間的比較。

（G）常規(guī)測(cè)試和多重ELISA中包括的細(xì)胞特異性比例與臨床參數(shù)之間的相關(guān)熱圖察滑。

斯皮爾曼相關(guān)性的^? p <0.05打厘，^?? p <0.01和^??? p <0.001。顏色強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于相關(guān)系數(shù)贺辰。

縮寫如下：DC户盯，樹突狀細(xì)胞；樹突狀細(xì)胞饲化。PB莽鸭，PBs；MK吃靠，巨核細(xì)胞硫眨；HSC，造血干細(xì)胞巢块；MEP礁阁，巨核細(xì)胞-紅系祖細(xì)胞；CMP夕冲，普通骨髓祖細(xì)胞氮兵；GMP，粒細(xì)胞-單核祖細(xì)胞歹鱼。

3. 全血轉(zhuǎn)錄組特征沿COVID-19疾病軌跡動(dòng)態(tài)變化

1. 作者接下來(lái)分析了13個(gè)住院患者的全血轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)泣栈，從最多5個(gè)時(shí)間點(diǎn)開始與恢復(fù)對(duì)照進(jìn)行比較，并將特征與14個(gè)健康對(duì)照進(jìn)行比較（圖3 A）。
2. 主成分分析顯示南片，健康對(duì)照組和COVID-19患者之間在第一主成分（PC1）上存在分離（圖3 B）掺涛。
3. 在健康對(duì)照和COVID-19患者之間，在對(duì)照與每種疾病軌跡假時(shí)的成對(duì)比較中疼进，共有5,915個(gè)基因差異表達(dá)（圖3 C和S3I）薪缆。與健康對(duì)照組相比，COVID-19患者中大多數(shù)差異表達(dá)基因（DEG）的表達(dá)水平更高（圖3 C和S3 A）伞广。早期變化包括免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄本（IGHA1和IGHG1）和乳鐵蛋白（LTF）的增加拣帽，而編碼Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子（TF）和II類HLA轉(zhuǎn)錄本的RORC mRNA水平在整個(gè)病程中均下降。
4. ImpulseDE2來(lái)構(gòu)建DEG的個(gè)體內(nèi)部隨時(shí)間變化的模型（Sander等人嚼锄，2017年）减拭。作者確定了935個(gè)DEG，它們遵循整個(gè)疾病軌跡的脈沖狀進(jìn)展模式（圖3 D和S3一種）区丑。
5. IL-1β和血管舒張信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因在增量軌跡中（擬時(shí)序1）高表達(dá)拧粪。從逐漸恢復(fù)到晚期恢復(fù)期（擬時(shí)序1、3和4）沧侥，編碼核糖體結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄物大量減少可霎，這可能反映了I型干擾素對(duì)蛋白合成裝置的普遍抑制（Jiang等， 1997）宴杀。相反癣朗，在疾病活動(dòng)高峰期，與IFN相關(guān)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯著增加婴氮，但是在關(guān)鍵疾病類別中卻受到抑制（圖3 D和S3 B）斯棒，證實(shí)了較早的報(bào)道（Blanco-Melo等盾致， 2020年主经；Hadjadj等人，2020年）庭惜。涉及髓樣細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和嗜中性粒細(xì)胞脫粒的轉(zhuǎn)錄本在擬時(shí)序1罩驻、3和4期間適度增加，但在關(guān)鍵擬時(shí)序2期間則顯著增加护赊。值得注意的是惠遏，在后期恢復(fù)期（擬時(shí)序5和6）链峭，強(qiáng)烈的紅系信號(hào)可檢測(cè)到細(xì)胞分化（例如HBD轿衔，OPTN和FIS1），表明對(duì)缺氧有反應(yīng)（Ashrafi和Schwarz瘪匿，2013年）判耕。
6. 作者使用基因組資源DoRothEA通過(guò)豐富的調(diào)節(jié)子分析來(lái)推斷轉(zhuǎn)錄因子（TF）活性透绩。活動(dòng)性疾病中的TF與炎癥和IFN信號(hào)傳導(dǎo)（例如IRF1和STAT3）以及低氧信號(hào)傳導(dǎo)（HIF1A）有關(guān)（圖S3 C）。支持在單細(xì)胞分析的第一部分中確定的IL-21-PB軸帚豪，據(jù)預(yù)測(cè)PRDM1（由BLIMP-1編碼）在關(guān)鍵和恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)均具有顯著活性碳竟。對(duì)REACTOME數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的所有活動(dòng)TF的超幾何測(cè)試顯示，“細(xì)胞分化途徑”（q = 0.03）和“ MK發(fā)育與血小板生成”（q = 0.05）豐富狸臣。
7. 通過(guò)使用有符號(hào)和有方向的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用莹桅，利用上游網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行基因表達(dá)改變（Liu等人，2019年）烛亦，作者可以證明MAPK3（也稱為ERK1）和MAPK1（也稱為ERK2）在所有擬時(shí)序中具有最高的中心性（圖S3 D）诈泼。
8. 作者使用各自的DEG進(jìn)一步構(gòu)建了每個(gè)假時(shí)的代謝模型（Gebauer等人，2016）煤禽，發(fā)現(xiàn)與康復(fù)和健康個(gè)體相比厂汗，炎性疾病狀態(tài)與更高數(shù)量的預(yù)測(cè)代謝活性途徑相關(guān)（圖S3 E）。作者還調(diào)查了大量RNA數(shù)據(jù)集是否存在病毒讀取呜师，并且未在任何樣品中檢測(cè)到相關(guān)量（> 10）的病毒讀取娶桦。陰性常規(guī)實(shí)時(shí)PCR（E基因和S基因擴(kuò)增子）也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)（數(shù)據(jù)未顯示）。

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圖3COVID-19中全血基因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)

（A）原理圖工作流程汁汗。

（B）基于所有基因的表達(dá)的所有對(duì)照和COVID-19樣品的PCA圖衷畦。樣本通過(guò)其擬時(shí)序進(jìn)行顏色編碼，并通過(guò)患者或個(gè)人ID進(jìn)行標(biāo)記知牌。

（C）記錄控件與每個(gè)COVID-19擬時(shí)序（x軸）之間DEG的₂倍變化（y軸）祈争。顏色區(qū)分具有增加的（紅色）或減少的（藍(lán)色）表達(dá)的基因，并且點(diǎn)大小代表統(tǒng)計(jì)顯著性（調(diào)整后的p值）角寸。點(diǎn)的透明度表示基因顯著差異表達(dá)的比較次數(shù)菩混。表達(dá)增加和減少的基因數(shù)量分別寫在圖的頂部和底部。

（D）跨COVID-19擬時(shí)序（擬時(shí)序1扁藕、3沮峡、4、5和6）的前500個(gè)縱向DEG的熱圖亿柑。顯示了對(duì)照和擬時(shí)序2中的基因表達(dá)邢疙，分別用于在熱圖的左端和右端進(jìn)行比較。歸一化計(jì)數(shù)的逐行z分?jǐn)?shù)繪制在熱圖中望薄。通過(guò)使用它們的鄰接得分作為距離疟游，將基因按層次進(jìn)行聚類。

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圖S3

4. 縱向共表達(dá)模塊可確定關(guān)鍵疾病中干擾素應(yīng)答的受損以及血栓和紅細(xì)胞生成增加的特征

1. 作者使用從成對(duì)和縱向分析（6,317個(gè)基因）的組合中識(shí)別出的所有DEG進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Langfelder和Horvath痕支，2008颁虐；Lee等，2004）卧须。分析確定了共10個(gè)共表達(dá)基因的模塊另绩，作者稱之為M1-M10瞬痘，它們?cè)谡麄€(gè)COVID-19疾病階段遵循不同的表達(dá)方式（圖4 A和S3 F；表S3）板熊。
2. 作者評(píng)估模塊與scRNA-seq衍生的細(xì)胞組成（圖4 B）和臨床參數(shù)（圖4）之間的個(gè)體相關(guān)性C）框全。在scRNA-seq數(shù)據(jù)上預(yù)測(cè)每個(gè)模塊的中樞基因的表達(dá)，揭示了細(xì)胞類型和擬時(shí)序特異性表達(dá)模式（圖S4）干签〗虮纾基因集富集分析揭示了每個(gè)模塊中富集的生物學(xué)過(guò)程和途徑。
3. 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）推論（Breuer等容劳，2013）被用來(lái)描述推定的TF喘沿。M2代表I型IFN反應(yīng)和增殖活性（G2M過(guò)渡）的特征（圖4 D），并且富含IRF1竭贩，STAT1和STAT2的結(jié)合位點(diǎn)（圖S3G）蚜印。
4. M4與外周血以及D-二聚體中MK的存在有關(guān)，并且具有兩個(gè)表達(dá)峰留量，分別在臨界狀態(tài)（擬時(shí)序2）和早期恢復(fù)期（擬時(shí)序4）窄赋。
5. M7包含與血紅蛋白生物合成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，并與GATA-1和GATA-2的TFBS基序重合楼熄，這是與類紅細(xì)胞分化相關(guān)的TF（圖S3 G）忆绰。這種雙相性模式可能與高度急性炎癥期間的缺氧（第一個(gè)峰值）和恢復(fù)期中斷補(bǔ)充氧氣（第二個(gè)峰值）有關(guān)。

總而言之可岂，對(duì)患者全血中時(shí)間基因表達(dá)模式的分析清楚地描繪了沿著理想疾病軌跡發(fā)生的SARS-CoV-2病毒感染的病理生理結(jié)果错敢。

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圖4差異表達(dá)基因的共表達(dá)分析和甲基化變化的整合

（A）通過(guò)使用所有成對(duì)的和縱向的DEG構(gòu)建的共表達(dá)模塊的組本征基因熱圖。繪制每個(gè)擬時(shí)序內(nèi)所有樣本的平均特征值缕粹≈擅基因的數(shù)量以條形圖的形式繪制（右圖）。

（B）相關(guān)熱圖顯示了基因共表達(dá)模塊（行）與來(lái)自scRNA-seq數(shù)據(jù)（列）的細(xì)胞特異性比例之間的Spearman秩相關(guān)系數(shù)平斩。斯皮爾曼相關(guān)性的^? p <0.05亚享，^?? p <0.01和^??? p <0.001。顏色強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于相關(guān)系數(shù)双戳。

（C）相關(guān)熱圖顯示基因共表達(dá)模塊（行）與臨床參數(shù)（列）之間的Spearman秩相關(guān)系數(shù)虹蒋。斯皮爾曼相關(guān)性的^? p <0.05，^?? p <0.01和^??? p <0.001飒货。顏色強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于相關(guān)系數(shù)。

（D）點(diǎn)圖顯示了針對(duì)GO（生物過(guò)程）峭竣，Hallmark和《京都議定書》的基因和基因組百科全書（KEGG）基因集的基因共表達(dá)模塊的基因集富集分析（GSEA）塘辅。點(diǎn)的大小與歸一化的富集得分（NES）成正比，顏色對(duì)應(yīng)于錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）皆撩。所選的熱門術(shù)語(yǔ)將可視化扣墩。

（E）對(duì)全血EPIC陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行的分析及其與大量RNA-seq數(shù)據(jù)的集成的示意性工作流程哲银。

（F）控件與每個(gè)COVID-19擬時(shí)序之間顯著DMP的數(shù)量。與來(lái)自對(duì)照的顏色相比呻惕，顏色區(qū)分了COVID-19樣品中的甲基化過(guò)高的位置（紅色）和甲基化過(guò)低的位置（藍(lán)色）荆责。

（G）每個(gè)擬時(shí)序前30,000個(gè)DMP之間的DMP比較。垂直條形圖指示在時(shí)間點(diǎn)（右側(cè)）之間共享的特定DMP的數(shù)量（左側(cè)）亚脆，這些點(diǎn)表示為連接的點(diǎn)（底部）做院。僅顯示選定的重疊。

（H）熱圖顯示了在不同COVID-19擬時(shí)序鑒定出的DMP中濒持，TFBS在TFBS中的顯著富集（通過(guò)比值比量化）键耕。

（I）點(diǎn)圖顯示富含DMP-DEG對(duì)的GO項(xiàng)。點(diǎn)的大小與基因比例成正比柑营，顏色對(duì)應(yīng)于富集的p值屈雄。

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圖S4

5. 全血DNA甲基化分析揭示了與基因表達(dá)相關(guān)的COVID-19中的全基因組低甲基化

1. 作者研究了DNA甲基化（DNAM）沿COVID-19疾病模式當(dāng)然下列中描述的工作流程。圖4E中相同的患者的一個(gè)子集（n = 6）（表S1）和具有六個(gè)健康年齡的人群相比官套，它們和性別匹配的控件酒奶。
2. 與健康對(duì)照進(jìn)行成對(duì)比較，并在擬時(shí)序之間鑒定出46,071和69,733個(gè)差異甲基化的CpG位點(diǎn)（圖4 F奶赔，4G和S5 B）讥蟆。與健康對(duì)照相比，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都存在大量的低甲基化位點(diǎn)纺阔。細(xì)胞反卷積分析（Müller,2019）鑒定出與COVID-19相關(guān)的DNAm基因的主要部分來(lái)自粒細(xì)胞瘸彤，B細(xì)胞，NK細(xì)胞和單核細(xì)胞（圖S5 A）笛钝。
3. 使用基因座重疊分析推斷差異甲基化的TF結(jié)合位點(diǎn)（Sheffield和Bock质况，2016年），作者觀察到CCAAT增強(qiáng)劑結(jié)合蛋白Beta（CEBPB）在低甲基化區(qū)域中的結(jié)合位點(diǎn)顯著過(guò)量表達(dá)（圖4 H）玻靡，這一點(diǎn)非常關(guān)鍵緊急粒細(xì)胞生成的作用（Hirai等结榄，2006）和B淋巴細(xì)胞向粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，這一過(guò)程已在重癥的COVID-19中提出（Wilk等囤捻，2020）臼朗。
4. 作者采用了分層測(cè)試方法（Pan等人，2018）來(lái)鑒定轉(zhuǎn)錄組和順式DNAm基因之間的相互作用（圖4 E）蝎土。為此视哑，作者在所有DEG（組合組）的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上下游的5 kb窗口內(nèi)篩選了差異甲基化位置（DMP）。在所有3,280個(gè)DMP-DEG對(duì)中誊涯，有68.3％的人顯示出增加的表達(dá)而甲基化程度降低或表達(dá)的減少而增加了甲基化程度挡毅，這與之前的研究一致（H?sler等人，2012）暴构。
5. 接下來(lái)跪呈，作者研究了共表達(dá)模塊M1-M10中DMP-DEG對(duì)的表示段磨。基于等級(jí)的相關(guān)性分析確定了所有模塊中的DMP-DEG對(duì)耗绿，并且在M3和M8中存在明顯的過(guò)势恢В現(xiàn)象（圖S5 C和S5D）。
6. DMP-DEG對(duì)的基因本體（GO）術(shù)語(yǔ)富集分析表明误阻，DEG中固有免疫相關(guān)術(shù)語(yǔ)的富集具有增加的表達(dá)（例如TNF和IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Toll樣受體[TLR]途徑）债蜜，并且還鑒定了與血小板功能和代謝過(guò)程（ATP代謝和自噬）有關(guān)的基因集（圖4I）。
7. 將DMP-DEG對(duì)基因在發(fā)炎期增加（擬時(shí)序1-4）或在后期恢復(fù)期減少（擬時(shí)序5和6）堕绩，將其映射到scRNA-seq數(shù)據(jù)策幼，鑒定出較大的細(xì)胞類型特異性DMP-簇PB，單核細(xì)胞和MK的DEG對(duì)（圖S5 E和S5F）奴紧。

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圖S5

6. 整個(gè)COVID-19疾病軌跡的成漿細(xì)胞和B細(xì)胞變化

1. 鑒于作者的發(fā)現(xiàn)指向了沿COVID-19疾病軌跡變化的B細(xì)胞群特姐，作者接下來(lái)將更詳細(xì)地研究B細(xì)胞譜系（圖5 A）。
2. 作者首先從隊(duì)列1的scRNA-seq數(shù)據(jù)中提取了22190個(gè)細(xì)胞黍氮，并將其識(shí)別為B細(xì)胞譜系的一部分唐含。UMAP嵌入識(shí)別出兩個(gè)反映真實(shí)B細(xì)胞的不同大簇，其中包括11509個(gè)記憶B細(xì)胞沫浆，3993個(gè)幼稚B細(xì)胞捷枯，383個(gè)過(guò)渡性B細(xì)胞。和6,295 PB細(xì)胞（圖5 B）专执。
3. 在COVID-19期間淮捆，PB在很大程度上處于擴(kuò)張狀態(tài)，在高炎癥期處于最高水平（圖5 C）本股。
4. 多色流式細(xì)胞證實(shí)大量循環(huán)CD27的^喜CD20 ^-在CD19的級(jí)分的細(xì)胞⁺細(xì)胞攀痊，隨著疾病的恢復(fù)而下降。同樣地拄显，幼稚（CD20的早期相對(duì)降低⁺ CD27 ^- ）和記憶B細(xì)胞（CD20 ⁺ CD27 ⁺）達(dá)到在歸一化后的時(shí)間點(diǎn)（圖5 D）苟径。
5. 作者還發(fā)現(xiàn)炎癥階段（假時(shí)1-4）中有很大一部分HLA-DR ⁺ CD138 ⁺雙陽(yáng)性PBs。而CD138 ⁺細(xì)胞僅在活動(dòng)性疾病豐富而不是在恢復(fù)期躬审，82％-98所有CD27的％^喜CD20 ^-細(xì)胞保持HLA-DR ⁺（圖S6F）棘街。
6. 值得注意的是，由于PB對(duì)操作非常敏感承边，因此作者認(rèn)識(shí)到遭殉，與流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)相比，針對(duì)scRNA-seq（也適用于隊(duì)列2）的處理程序減少了完整PB的數(shù)量炒刁，而保留了PB數(shù)量增加的縱向動(dòng)態(tài)兩種方法之間恩沽。
7. 作者可以區(qū)分出較小的PB簇，這些PB簇表達(dá)與嗜中性粒細(xì)胞相關(guān)的基因（例如ELANE翔始，MPO和CAMP）（圖5 E）罗心。與之前的研究不同（Wilk等，2020）城瞎，作者還在健康受試者中發(fā)現(xiàn)了這種細(xì)胞渤闷，盡管頻率較低（圖5 C）。（使用monocle3 脖镀。Qiu等人飒箭，2017），作者強(qiáng)調(diào)過(guò)渡B細(xì)胞的細(xì)胞軌跡成幼稚和記憶B細(xì)胞蜒灰，與單獨(dú)的記憶B細(xì)胞簇是最有可能的CD45RB ^-細(xì)胞（Glass等人弦蹂，2020, 圖5F）。作者可以追溯PB的進(jìn)展强窖，PB的進(jìn)展不是基于免疫球蛋白類別而是基于疾病狀態(tài)凸椿，而來(lái)自高炎癥期的細(xì)胞則與軌跡的根部距離更遠(yuǎn)（圖S6 A和S6B）。中性粒細(xì)胞樣PB細(xì)胞未連續(xù)鏈接到PB軌跡（圖5 F）翅溺。

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圖5B細(xì)胞分析可確定整個(gè)COVID-19疾病軌跡的成漿細(xì)胞變化

（A）原理圖工作流程脑漫。

（B）以UMAP表示的B細(xì)胞群亞型×椋總共描繪了22,190個(gè)細(xì)胞优幸。記憶B細(xì)胞（MB）（深紅色），幼稚B細(xì)胞（N）（紅色）褪猛，過(guò)渡性B細(xì)胞（反式）（橙色）和成漿細(xì)胞（PB）（藍(lán)色）网杆。

（C）B細(xì)胞群擬時(shí)序表示為UMAP。

（D）B細(xì)胞亞型的流式細(xì)胞儀分析伊滋。CD19 ⁺ B細(xì)胞的CD20和CD27染色碳却。CD20 ^- CD27^高列為PB B細(xì)胞，CD20 ⁺ CD27 ⁺細(xì)胞作為MB新啼，和CD20 ⁺ CD27 ^-細(xì)胞作為CD19中的每個(gè)細(xì)胞類型的比例N. ⁺ B細(xì)胞是相對(duì)于所述疾病發(fā)作追城，由相應(yīng)pseudotime著色，和由患者連接燥撞。（n = 7個(gè)人）座柱。

（E）PB特異性UMAP突出了嗜中性粒細(xì)胞樣細(xì)胞（NL）。較小的UMAP與PB標(biāo)記（CD27物舒，CD38和TNFRSF17）和中性粒細(xì)胞樣標(biāo)記（ELANE色洞，MPO和CAMP）的表達(dá)相對(duì)應(yīng)。

（F）B細(xì)胞群的細(xì)胞軌跡分析冠胯。通過(guò)使用Monocle3計(jì)算細(xì)胞軌跡火诸。該分析源于過(guò)渡性B細(xì)胞（紫色），并分為2個(gè)分支：B細(xì)胞幼稚和記憶分支（灰色線荠察，以黃色結(jié)束）和過(guò)度使用的PB分支（黑色線置蜀，以橙色結(jié)束）奈搜。

（G）PB中擬時(shí)序基因基因的點(diǎn)圖。根據(jù)十個(gè)最具特征的基因表達(dá)增加來(lái)選擇基因盯荤。顏色區(qū)分具有增加的（紅色）表達(dá)或減少的（藍(lán)色）表達(dá)的基因馋吗，點(diǎn)大小代表每組表達(dá)相應(yīng)基因的細(xì)胞數(shù)。

（H）GO富集分析疾病軌跡中表達(dá)增加的基因秋秤。點(diǎn)的大小與基因比例成正比宏粤，而顏色則對(duì)應(yīng)于富集的p值。所選的熱門術(shù)語(yǔ)將可視化灼卢。

（I）B細(xì)胞亞型中目的基因的基因表達(dá)绍哎。根據(jù)感興趣的基因在PB或NL中的高表達(dá)來(lái)選擇它們。對(duì)于每個(gè)基因鞋真，描繪B細(xì)胞亞型表達(dá)的頂部小提琴圖崇堰，基于擬時(shí)序的中央小提琴圖和基于同類群組2（健康對(duì)照[白色]，輕度疾病[淺灰色]和重癥疾病[深色]）表達(dá)的底部小提琴圖灿巧「习溃灰色的]）。

（J）富含B細(xì)胞群亞型的代謝途徑抠藕。顯示了在PB中重建的針對(duì)特定情境的代謝網(wǎng)絡(luò)的前20條活躍代謝途徑饿肺。對(duì)于每種B細(xì)胞亞型，通過(guò)使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)確定了代謝活性的顯著差異盾似。每個(gè)通道發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)計(jì)數(shù)數(shù)量顯示為顏色強(qiáng)度敬辣。

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圖S6

8. 接下來(lái)，作者使用重鏈散裝和scBCR-seq分析了不同B細(xì)胞群中的BCR組成（圖S6 D零院，S6E和S6G-S6P）溉跃。在整體數(shù)據(jù)集中，作者共確定了596,882個(gè)唯一的BCR CDR3重鏈序列告抄，而對(duì)于scBCR-seq撰茎，作者擁有涉及14,785個(gè)細(xì)胞的信息。
9. 多樣性分析顯示克隆性增強(qiáng)打洼，在早期時(shí)間點(diǎn)急劇增加龄糊，然后在恢復(fù)期的擬時(shí)序逐漸降低，直到隨訪正衬即化（圖S6 D和S6E）炫惩。大量的BCR在記憶B細(xì)胞和PB（圖S5 H和S5J）中都鑒定出IgA ⁺和IgG ⁺細(xì)胞的擴(kuò)增（圖S5 G和S5I ）。
10. IGHA1增加和IGHG1更早在PBS中比在記憶B細(xì)胞達(dá)到表達(dá)阿浓。在scBCR-seq數(shù)據(jù)中確認(rèn)了擴(kuò)展的IgA ⁺和IgG ⁺ PB（圖S5 K和S5N）他嚷。對(duì)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)（IGHV）家族亞基的分析（圖S5 L，S5M，S5O和S5P）顯示筋蓖，與對(duì)照組（例如IGHV3-30和IGHV3-）相比卸耘，COVID-19患者的特定V區(qū)占優(yōu)勢(shì)疾病期間PB和中性粒細(xì)胞樣細(xì)胞中有23個(gè)過(guò)高表達(dá)

COVID-19中B細(xì)胞克隆性的增加，并且記憶B細(xì)胞和PB的增加扭勉，主要由IgA和IgG同種型以及IGHV的偏斜使用引起基因在疾病過(guò)程的早期鹊奖。

11. 接下來(lái)苛聘，作者分析了6,295 PB的縱向基因表達(dá)模式（圖5 G）涂炎。COVID-19患者的炎癥性增高期的特征在于與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激和蛋白質(zhì)折疊（例如XBP1）和細(xì)胞增殖（例如PIM2和S100A4）有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。PB中存在I型IFN反應(yīng)基因（IFI27设哗，IFI6和IFITM1）唱捣，直到疾病晚期（至擬時(shí)序5為止），但危重患者的PB中則不存在此類基因（擬時(shí)序2）网梢。
12. 在整個(gè)疾病中震缭，作者還發(fā)現(xiàn)SLC1A4表達(dá)增加，這是代謝變化的潛在上游調(diào)節(jié)劑（圖5 I）战虏。IL-16的高表達(dá)可在體液免疫應(yīng)答啟動(dòng)期間支持CD4 ⁺ T細(xì)胞和循環(huán)血樹突狀細(xì)胞（DC）向淋巴器官的遷移（Kaser等拣宰，2000），這是 PB長(zhǎng)期恢復(fù)的一個(gè)特征烦感。（圖5 G）巡社。
13. GO富集分析確定了活動(dòng)性疾病期間未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)和線粒體ATP合成增加（圖5 H）。通過(guò)使用另一種scRNA-seq技術(shù)手趣，在輕度和重度COVID-19患者的獨(dú)立隊(duì)列（隊(duì)列2）中也證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（Schulte-Schrepping等人晌该，2020年）。
14. 從該數(shù)據(jù)集中提取的2,263個(gè)PBs證實(shí)了重度與輕度COVID-19 PBs的強(qiáng)烈增加（分別占整個(gè)B細(xì)胞譜系的30％和8％）绿渣，以及CD38朝群，PIM2，IFI6中符，XBP1和SLC1A4等的表達(dá)增加富集的GO項(xiàng)（Fisher檢驗(yàn)姜胖，未折疊的蛋白反應(yīng)p = 1.80×10 ^-5，線粒體ATP合成p = 2.50×10 ^-8）淀散。
15. PB可以通過(guò)充當(dāng)營(yíng)養(yǎng)庫(kù)來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)（Vijay等右莱，2020）。因此吧凉，作者使用了基于約束的模型來(lái)從scRNA-seq數(shù)據(jù)重建單個(gè)細(xì)胞的代謝狀態(tài)（Joshi等人隧出，2020年; Pacheco和Sauter，2018年）阀捅。來(lái)自炎癥狀態(tài)的PB表現(xiàn)出較高的代謝活性胀瞪，僅在恢復(fù)時(shí)才降低，而記憶和幼稚B細(xì)胞在疾病狀態(tài)之間的總體代謝活性上沒(méi)有顯示出顯著差異（圖S7L）。PB中增加的代謝過(guò)程是氧化磷酸化凄诞，乙醛酸和二羧酸酯代謝圆雁，NAD合成以及各種氨基酸代謝途徑（包括甘氨酸，絲氨酸帆谍，丙氨酸伪朽，蘇氨酸，纈氨酸汛蝙，亮氨酸和異亮氨酸）的增加烈涮。預(yù)計(jì)糖酵解在炎癥疾病階段具有低活性狀態(tài)，而在臨床恢復(fù)中則具有很高的活性（擬時(shí)序6）（圖5 J）窖剑〖崆ⅲ總而言之，該分析確定了PBs的廣泛活化西土，并暗示了細(xì)胞向氨基酸代謝的強(qiáng)烈的免疫代謝轉(zhuǎn)變讶舰，這可能有助于重癥COVID-19中所見(jiàn)的免疫病理學(xué)。

7. 巨核細(xì)胞數(shù)量升高是對(duì)COVID-19的全身炎癥反應(yīng)的特征

1. 眾所周知需了，全身性炎癥反應(yīng)會(huì)消耗血小板跳昼，血小板除了具有公認(rèn)的止血作用外，還具有廣泛的免疫和炎癥功能（Semple等肋乍，2011鹅颊；Yeaman，2014）住拭。肺栓塞和腦栓塞是導(dǎo)致COVID-19發(fā)病率和死亡率的重要因素（Liao等挪略，2020）。鑒于作者已經(jīng)觀察到循環(huán)MK的瞬時(shí)增加滔岳，這是血小板的細(xì)胞來(lái)源（圖2B）杠娱，在單細(xì)胞數(shù)據(jù)和與血小板計(jì)數(shù)和D-二聚體水平相關(guān)的已確定的共表達(dá)模塊（M3和M4）中，作者假設(shè)改變MK的存在和功能可能是COVID-19的獨(dú)特特征谱煤。
2. 因此摊求，作者通過(guò)使用進(jìn)行鑒定為MKS和它們各自的造血干細(xì)胞前體細(xì)胞（造血干細(xì)胞）和MK-紅細(xì)胞前體（MEPS）6512個(gè)細(xì)胞亞聚類? -nearest鄰法（圖6 A和S7 A）。
3. 這些細(xì)胞分為2個(gè)不同的亞組：5,870個(gè)被鑒定為真正的MK刘离，另一個(gè)較小的包含所有HSC和MEP的簇（圖6 B室叉，S7B和S7C）。相對(duì)較少的細(xì)胞前體細(xì)胞使單個(gè)擬時(shí)序之間的比較變得復(fù)雜（圖S7 D–S7G）硫惕。
4. 與健康對(duì)照組相比茧痕，恢復(fù)期的HSC和MEP顯著增加（圖S7 J）。
5. 通過(guò)僅關(guān)注MK恼除，作者發(fā)現(xiàn)屬于健康對(duì)照的樣本與具有活性COVID-19的患者之間存在明顯的分離（圖6 C）踪旷，
6. 特別是來(lái)自復(fù)雜疾病階段的細(xì)胞與健康和長(zhǎng)期恢復(fù)的細(xì)胞形成了不同的亞群曼氛。疾病階段（圖6 D和6E）。
7. 在危重患者中觀察到偽編碼丙酮酸激酶的PKM轉(zhuǎn)錄量（PKM2）大量增加令野，并與HIF1A相互作用并促進(jìn)其活性（擬時(shí)序2）舀患。在這一組中，還存在高表達(dá)的FCER1G气破，它編碼負(fù)責(zé)整合素（ITGA2-GP6）介導(dǎo)的血小板粘附的常見(jiàn)FcRγ鏈銜接子（圖6E）聊浅。
8. GO富集分析確定了與免疫應(yīng)答透罢，I型IFN應(yīng)答和血小板聚集相關(guān)的廣泛術(shù)語(yǔ)衷模，這些術(shù)語(yǔ)將沿疾病軌跡改變（圖6 G）。
9. 暫時(shí)減少的轉(zhuǎn)錄本由ODC1（鳥氨酸脫羧酶）谴忧，多胺合成的限速酶（Kanerva等朴下，2008）和TGFB1組成（圖6 F）努咐。IFITM3，IFI27和IFITM2在炎性擬時(shí)序1殴胧、2、3和4中表達(dá)增加佩迟，表明在整個(gè)MKs疾病軌跡中团滥，IFN持續(xù)存在。
10. 此外报强，作者在輕度和重度COVID-19的獨(dú)立隊(duì)列中驗(yàn)證了作者的發(fā)現(xiàn)（Schulte-Schrepping等人灸姊，2020年），這不僅證實(shí)了重癥患者中MK的數(shù)量更高（圖6 H）秉溉，而且證實(shí)了表達(dá)增加的IFITM3力惯，PKM，ITGA2B（也稱為CD41）和IFITM2以及重癥患者中ODC1和TGFB1的表達(dá)降低（圖6 F召嘶，底部）父晶。
11. 與健康對(duì)照組相比，代謝建模確定了MKs沿疾病軌跡增加的代謝活性弄跌，盡管其水平低于PBs（圖6 I）甲喝。顯著的預(yù)測(cè)過(guò)程與能量代謝（丙酮酸代謝，糖酵解和活性氧[ROS]解毒）有關(guān)（圖6 J和6I）铛只。
12. 代謝模型推斷糖酵解通向乳酸的通量顯著增加埠胖，甲基乙二醛途徑的誘導(dǎo)（Kalapos，2008）和已知抑制血小板聚集的亞精胺-多胺產(chǎn)物的減少（de laPe?aet al淳玩。直撤，2000）。

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圖6巨核細(xì)胞水平升高是COVID-19的特征

（A）原理圖工作流程蜕着。

（B）MK及其前身為UMAP谋竖。總共描繪了6,512個(gè)細(xì)胞。顯示了MK（綠色）圈盔，HSC（粉紅色）和MEP（黃色）豹芯。

（C）表示為UMAP的MK擬時(shí)序∏茫總共描繪了5,870個(gè)細(xì)胞铁蹈。

（D）跨COVID-19疾病軌跡的MK。對(duì)于每個(gè)UMAP众眨，用顏色突出顯示了擬時(shí)序特定的細(xì)胞握牧。

（E）MK中疾病軌跡特征基因的點(diǎn)圖。根據(jù)十個(gè)最具特征的基因的表達(dá)量選擇基因娩梨。顏色區(qū)分具有增加的（紅色）表達(dá)或減少的（藍(lán)色）表達(dá)的基因沿腰，點(diǎn)大小代表每組表達(dá)相應(yīng)基因的細(xì)胞數(shù)。

（F）在MK中表達(dá)目的基因狈定。根據(jù)疾病分類颂龙，基于擬時(shí)序的頂部小提琴圖和基于隊(duì)列2的底部小提琴圖；健康對(duì)照（白色）纽什，輕度疾泊肭丁（淺灰色）和重度疾病（深灰色）芦缰。

（G）GO富集分析在疾病軌跡中表達(dá)增加的基因企巢。點(diǎn)大小與基因比例成正比，顏色對(duì)應(yīng)于富集的p值让蕾。所選的熱門術(shù)語(yǔ)將可視化浪规。

（H）隊(duì)列2 MK比例按疾病重癥程度分組。描繪了健康對(duì)照（白色）探孝，輕度疾菜裥觥（淺灰色）和重度疾病（深灰色）再姑。

（I）富含MK的代謝途徑萌抵。顯示了針對(duì)特定背景的代謝網(wǎng)絡(luò)重建的頂級(jí)差異活性代謝途徑。通過(guò)使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)確定了代謝活性的顯著差異元镀。每個(gè)途徑的反應(yīng)計(jì)數(shù)數(shù)量顯示為顏色強(qiáng)度绍填。

（J）MKs中的丙酮酸代謝。描繪了擬時(shí)序的丙酮酸代謝途徑活性反應(yīng)的數(shù)量栖疑√钟溃基于Kruskal-Wallis檢驗(yàn)的p值。每個(gè)擬時(shí)序的模型數(shù)在每列上方表示為n遇革。

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圖S7

8. 一組重癥COVID-19患者的共表達(dá)模塊與臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)

1. 最后卿闹，作者集中研究了來(lái)自奈梅亨的拉德布德大學(xué)醫(yī)學(xué)中心（UMC）的40名機(jī)械通氣揭糕，重癥COVID-19患者的縱向隊(duì)列在臨床背景下獲得的基因的潛在重要性（隊(duì)列3）（表S4）。
2. 該隊(duì)列中的大量RNA測(cè)序數(shù)據(jù)是在入ICU的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得的锻霎。作者使用匹配的樣本對(duì)著角，其幸存者（n = 33）和非幸存者（n = 7）具有類似的增加的炎癥活性變化，并詢問(wèn)模塊基因表達(dá)量的變化（M1-M10旋恼，如德國(guó)縱向隊(duì)列[隊(duì)列1]最初在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間（圖7）顯示在圖4 A中一種）吏口。
3. 第一個(gè)樣本是在ICU入院后3天中位數(shù)獲得的，時(shí)間點(diǎn)之間的中位數(shù)時(shí)間為2天冰更，幸存和未幸存的患者之間沒(méi)有系統(tǒng)性差異产徊。非幸存者的第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)在死亡前4–35天之間變化。在此縱向比較中蜀细，三個(gè)模塊得到了顯著調(diào)節(jié)舟铜。
4. 與I型IFN反應(yīng)失敗相關(guān)的M2轉(zhuǎn)錄本在幸存者和非幸存者中均顯著降低，從而證實(shí)了IFN失調(diào)與重癥疾病之間的關(guān)聯(lián)（Blanco-Melo等人奠衔，2020 ; Hadjadj等人谆刨，2020）。
5. M4表示外周血中的MK以及升高的D-二聚體水平和M7轉(zhuǎn)錄物涣觉，與紅系分化和MK相關(guān)痴荐，僅在COVID-19非幸存者中比 2天后的隨訪時(shí)間點(diǎn)較ICU入院時(shí)的樣本和MCU的變化顯著增加。（圖7B）官册。
6. 在一種相反的方法中，作者詢問(wèn)幸存者和非幸存者在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間哪些轉(zhuǎn)錄本在縱向上顯示出不同的表達(dá)方式难捌。作者發(fā)現(xiàn)膝宁，在幸存者中只有3個(gè)轉(zhuǎn)錄物受到調(diào)控，而在非幸存者中有182個(gè)轉(zhuǎn)錄物顯著不同（圖7 C）根吁。
7. 在這些轉(zhuǎn)錄本中员淫，有130個(gè)包含在隊(duì)列1的先前定義的時(shí)間共表達(dá)模塊中，其中大量涉及M2击敌，M4和M7的轉(zhuǎn)錄本介返。這些與死亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本的細(xì)胞類型特異性表達(dá)模式（每種細(xì)胞類型的平均表達(dá)值，來(lái)源于scRNaseq隊(duì)列1）顯示沃斤，M2基因的標(biāo)記標(biāo)記了各種各樣的細(xì)胞類型圣蝎，例如單核細(xì)胞，粒細(xì)胞衡瓶，NK細(xì)胞徘公，增殖淋巴細(xì)胞和CD8 +T細(xì)胞，M3和M4基因主要對(duì)單核細(xì)胞具有特異性哮针，很少有歸因于MK的高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本关面。M7基因的很大一部分都涂上了類紅細(xì)胞譜系坦袍，在MK中特異性表達(dá)了一個(gè)單獨(dú)的簇，例如PBX1等太，TRIM58和PDZK1IP1（圖7 D）捂齐。
8. 最后，作者通過(guò)使用limma的中度t檢驗(yàn)量化了幸存者和非幸存者中TFs隨時(shí)間的差異調(diào)節(jié)（Ritchie等人缩抡，2015年）奠宜。分析確定了僅在非幸存者中被差異調(diào)節(jié)的16個(gè)TF，在幸存者中有7個(gè)TF（圖7 E）缝其。REACTOME通路富集顯示挎塌，在非幸存者TF中，術(shù)語(yǔ)“MK發(fā)育和血小板生成”（p = 0.0001）和“ TRAF6介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)”（P= 0.001）顯著豐富内边。

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圖7重癥COVID-19患者縱向隊(duì)列中共表達(dá)模塊的臨床意義

（A）原理圖工作流程榴都。

（B）M2，M4和M7在幸存者和非幸存者中兩個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)之間的模塊本征基因比較漠其。誤差棒表示四分位距離為1.5嘴高，* p <0.05（Mann Whitney測(cè)試）。

（C）火山圖和屎，描繪了非幸存者在兩個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)之間的log ₂倍變化和FDR調(diào)整后的p值拴驮。基因由相應(yīng)的共表達(dá)模塊進(jìn)行顏色編碼柴信。深色代表明顯的DEG套啤。

（D）熱圖顯示了在隊(duì)列1的不同細(xì)胞類型中在非幸存者中鑒定的DEG的平均表達(dá)（來(lái)自scRNA-seq數(shù)據(jù)）。顯示了該疾病重癥階段（擬時(shí)序1随常、2和3）的平均表達(dá)潜沦。逐行?平均基因計(jì)數(shù)的-scores繪制在熱圖和分層群集為每個(gè)模塊單獨(dú)地。

（E）火山圖绪氛，描繪了非幸存者（右）對(duì)幸存者（左）隨時(shí)間變化的TF活性與-log10轉(zhuǎn)換后的p值唆鸡。顯著TF（p <0.1）用紅色標(biāo)記。