前沿
表觀遺傳學(xué)，包括組蛋白共價(jià)修飾(covalent histone modification)、DNA甲基化修飾(DNA methylation)强重、RNA甲基化修飾(RNA methylation)礼旅、基因組印記(genomic imprinting)、基因沉默(gene silencing)俐东、RNA編輯(RNA editing)及非編碼RNA(noncoding RNA)等跌穗，是指在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，生物表型或基因表達(dá)發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳變化虏辫。
RNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容之一蚌吸，是指發(fā)生在RNA分子上不同位置的甲基化修飾現(xiàn)象，6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine砌庄，m6A)和5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine羹唠，m5C)是真核生物中最常見的兩種RNA轉(zhuǎn)錄后修飾。RNA甲基化在調(diào)控基因表達(dá)娄昆、剪接佩微、RNA編輯、RNA穩(wěn)定性萌焰、控制mRNA壽命和降解等方面可能扮演重要角色哺眯。 相對于DNA甲基化，RNA甲基化更加復(fù)雜扒俯、種類繁多族购、普遍存在于各種高級生物中。
已知絕大部分真核生物中寝杖，mRNA在5’ Cap處存在甲基化修飾，作用包括維持mRNA穩(wěn)定性互纯、 mRNA前體剪切瑟幕、多腺苷酸化、 mRNA運(yùn)輸與翻譯起始等留潦。而3’ polyA發(fā)生的修飾有助于出核轉(zhuǎn)運(yùn)只盹、翻譯起始以及與polyA結(jié)合蛋白?起維持mRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。但是這些修飾只發(fā)生mRNA的頭部和尾部兔院，關(guān)于RNA的內(nèi)部修飾（internal modification）在許多種類的RNA中都有發(fā)?殖卑。無論是mRNA還是lncRNA，都大量存在m6A修飾坊萝。m6A能夠加速mRNA前體的加工時(shí)間孵稽，加快mRNA在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)速度和出核速度许起。主要學(xué)習(xí)研究較多的m6A。RNA的m6A甲基化?共有大三類酶參與：Writers菩鲜、 Erasers和Readers园细，需要相關(guān)研究的可以學(xué)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)。
如何檢測m6A
檢測m6A的方法非常多接校，如包括MeRIPseq猛频、 miCLIP-seq、 SCARLET蛛勉、 LC-MS/MS等鹿寻。2012年之后，兩篇發(fā)表于Nature和Cell上的論?可以說是第?次從轉(zhuǎn)錄水平上诽凌，大范圍高通量地鑒定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）烈和。這兩篇獨(dú)立發(fā)表的論文采用的核心方法就是將m6A抗體與帶有m6A的mRNA片段相結(jié)合后進(jìn)行高通量測序。通過對下機(jī)數(shù)據(jù)的分析皿淋，來鑒定mRNA上m6A程度較高的區(qū)域招刹，分辨率約為100nt。這種方法我們稱之為MeRIP-seq（methylated RNA immunoprecipitation sequencing）或m6A-seq窝趣。
MeRIP-seq建庫步驟：
1. 提取total RNAs疯暑，并用Oligo-dT磁珠對total RNAs帶有polyA的mRNA進(jìn)行富集（通常要求Total RNA 300ug，人鼠可以做微量2ug 但結(jié)果可能會出現(xiàn)map率低dup率高 建庫步驟與常量也有區(qū)別）哑舒；
2. 用磁珠進(jìn)行富集妇拯，得到帶有polyA的mRNA。之后加入片段化試劑洗鸵，將完整的mRNA進(jìn)行片段化越锈。或者使用超聲波儀直接進(jìn)行片段化膘滨；
3. 將片段化后的RNA分成兩份甘凭。?份加入帶有m6A抗體的免疫磁珠，對含有m6A甲基化的mRNA片段進(jìn)?富集火邓。另?份作為control丹弱，直接構(gòu)建類似常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測序文庫（這一步就是IP步驟，片段化程度铲咨、抗體抓取效率都會影響到后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果躲胳；這里的control通常稱為Input）；
4. 對m6A抗體免疫磁珠進(jìn)行富集纤勒，帶有m6A的mRNA片段進(jìn)行回收后坯苹，按照轉(zhuǎn)錄組的建庫流程構(gòu)建常規(guī)的測序文庫；
5. 分別將構(gòu)建好的2個(gè)測序文庫摇天，即m6A-seq library和RNA-seq library分別進(jìn)行高通量測序粹湃。測序平臺保持一致恐仑，推薦Hiseq X ten或Novaseq；
6. 對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析再芋，對發(fā)生m6A甲基化程度較高的區(qū)域進(jìn)行peak calling菊霜。由于不能做到單個(gè)堿基的分辨率坚冀，所以只能對大致的區(qū)域進(jìn)行分析济赎。從下圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，與右側(cè)常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相比记某，在基因上有兩處區(qū)域存在非常明顯的高甲基化峰司训；
7.接下來會進(jìn)行一些常規(guī)分析，如peak區(qū)域基因注釋液南，差異peak分析壳猜。
以上就是關(guān)于m6A-seq的標(biāo)準(zhǔn)步驟，現(xiàn)在是不是對m6A-seq有了一個(gè)非常直觀的認(rèn)識呢滑凉？ 再次強(qiáng)調(diào)下统扳，這種測序方法只能鑒定高甲基化的區(qū)域，并不能做到單堿基的分辨率畅姊。
m6A研究思路
思路1 老數(shù)據(jù)挖掘
第一步：先從原有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中咒钟，挖掘到差異表達(dá)的甲基化酶；
第二步：對挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等進(jìn)?qPCR驗(yàn)證若未，并進(jìn)行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平發(fā)生改變朱嘴；
第三步：在細(xì)胞（動物模型可選）中對這些酶進(jìn)行敲低和過表達(dá)，進(jìn)行常規(guī)的qPCR和WB檢測相關(guān)酶表達(dá)情況粗合，并用LC-MS/MS法檢測RNA整體m6A水平萍嬉；
第四步：繼續(xù)對這些敲低和過表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序/小RNA測序或表達(dá)譜芯片/小RNA芯片，分析哪些基因出現(xiàn)差異表達(dá)變化和可變剪切變化隙疚；
第五步：找到甲基化酶調(diào)控的靶基因壤追，進(jìn)行敲低和過表達(dá)，看甲基化酶缺陷的細(xì)胞或動物模型表型能否補(bǔ)救供屉；
第六步：在確定上一步靶基因確實(shí)受到甲基化酶調(diào)控后大诸，對靶基因上的motif進(jìn)行點(diǎn)突變后進(jìn)行驗(yàn)證；
第七步：鑒定新型的甲基化酶（可選）贯卦。
思路2 研究甲基化修飾差異基因
第一步：直接進(jìn)行m6A-seq和轉(zhuǎn)錄組測序资柔，找到時(shí)間順序或差異表達(dá)的基因并用qPCR、 WB等?法驗(yàn)證撵割，此外找到m6A有差異的基因贿堰；
第二步：對甲基化酶進(jìn)行敲低和過表達(dá)，檢測RNA整體的m6A水平啡彬，之后可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組或小RNA測序等方法檢驗(yàn)甲基化酶敲低和過表達(dá)對mRNA或miRNA整體的影響羹与，并著重研究第?步中感興趣的m6A有差異的靶基因故硅；
第三步：對靶基因進(jìn)行敲低或過表達(dá)，是否能夠?qū)谆府惓１磉_(dá)后的表型進(jìn)?恢復(fù)纵搁；
第四步：對靶基因上motif進(jìn)行點(diǎn)突變后進(jìn)?步確認(rèn)直接受到甲基化酶調(diào)控吃衅；
第五步：鑒定新型的甲基化酶（可選）。
當(dāng)然根據(jù)不同的研究目的還有許多其他的研究思路腾誉，可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行延申和拓展徘层。m6A相關(guān)SCI論文根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)手段IF2~20不等，實(shí)驗(yàn)手段：m6A-seq利职、轉(zhuǎn)錄組測序/表達(dá)譜芯片趣效、 LC-MS/MS 或 m6A 比色法、小RNA 測序/小RNA芯片猪贪、qPCR跷敬、 WB、敲降/過表達(dá)热押、靶基因驗(yàn)證西傀、動物實(shí)驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)/藥物實(shí)驗(yàn)等桶癣。
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參考學(xué)習(xí)：
1鬼廓、高通量RNA甲基化測序數(shù)據(jù)處理與分析研究進(jìn)展
2肿仑、RNA修飾檢測技術(shù)
Roundtree, Ian A et al. “Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation.” Cell vol. 169,7 (2017): 1187-1200. doi:10.1016/j.cell.2017.05.045
Helm, M, & Y. Motorin. "Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.” Nature Reviews Genetics 18.5 (2017):275.
