**微生物群落多樣性的基本概念
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環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性和微生物的功能及代謝機(jī)理是微生物生態(tài)學(xué)的研究熱點(diǎn)枯夜。長期以來，由于受到技術(shù)限制燕雁，對微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的認(rèn)識(shí)還不全面瘸味，對微生物功能及代謝機(jī)理方面了解的也很少。但隨著高通量測序彻坛、基因芯片等新技術(shù)的不斷更新，微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法和研究途徑也在不斷變化踏枣。第二代高通量測序技術(shù)（尤其是Roche 454高通量測序技術(shù)）的成熟和普及昌屉，使我們能夠?qū)Νh(huán)境微生物進(jìn)行深度測序，靈敏地探測出環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)隨外界環(huán)境的改變而發(fā)生的極其微弱的變化茵瀑，對于我們研究微生物與環(huán)境的關(guān)系间驮、環(huán)境治理和微生物資源的利用以及人類醫(yī)療健康有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
在國內(nèi)马昨，微生物多樣性的研究涉及農(nóng)業(yè)竞帽、土壤扛施、林業(yè)、海洋屹篓、礦井疙渣、人體醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域。以在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用為例堆巧，通過比較正常和疾病狀態(tài)下或疾病不同進(jìn)程中人體微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能變化妄荔，可以對正常人群與某些疾病患者體內(nèi)的微生物群體多樣性進(jìn)行比較分析，研究獲得人體微生物群落變化同疾病之間的關(guān)系恳邀；通過深度測序還可以快速地發(fā)現(xiàn)和檢測常見病原及新發(fā)傳染病病原微生物懦冰。
**研究方法進(jìn)展
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環(huán)境微生物多樣性的研究方法很多，從國內(nèi)外目前采用的方法來看大致上包括以下四類：傳統(tǒng)的微生物平板純培養(yǎng)方法谣沸、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物學(xué)方法等等笋颤。
近幾年乳附，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是高通量測序技術(shù)的研發(fā)及應(yīng)用伴澄，為微生物分子生態(tài)學(xué)的研究策略注入了新的力量赋除。
目前用于研究微生物多樣性的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP非凌、SSCP举农、FISH、印記雜交敞嗡、定量PCR颁糟、基因芯片等。DGGE等分子指紋圖譜技術(shù)喉悴，在其實(shí)驗(yàn)結(jié)果中往往只含有數(shù)十條條帶棱貌，只能反映出樣品中少數(shù)優(yōu)勢菌的信息；另一方面箕肃，由于分辨率的誤差婚脱，部分電泳條帶中可能包含不只一種16S rDNA序列，因此要獲悉電泳圖譜中具體的菌種信息勺像，還需對每一條帶構(gòu)建克隆文庫障贸，并篩選克隆進(jìn)行測序，此實(shí)驗(yàn)操作相對繁瑣吟宦；此外篮洁，采用這種方法無法對樣品中的微生物做到絕對定量。生物芯片是通過固定在芯片上的探針來獲得微生物多樣性的信息督函，“只能驗(yàn)證已知嘀粱，卻無法探索未知”激挪，此方法通過信號(hào)強(qiáng)弱判斷微生物的豐度也不是非常的準(zhǔn)確。
而近年來以454焦磷酸測序?yàn)榇淼母咄繙y序技術(shù)憑借低成本锋叨、高通量垄分、流程自動(dòng)化的優(yōu)勢為研究微生物群落結(jié)構(gòu)提供了新的技術(shù)平臺(tái)。Roche 454高通量測序技術(shù)能同時(shí)對樣品中的優(yōu)勢物種娃磺、稀有物種及一些未知的物種進(jìn)行檢測薄湿，獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進(jìn)行數(shù)字化偷卧。最近豺瘤，美吉生物推出了新的測序平臺(tái)———MiSeq。MiSeq高通量測序平臺(tái)集中了Roche 454和Illumina HiSeq 2500的優(yōu)點(diǎn)听诸，不僅可實(shí)現(xiàn)對多樣品的多個(gè)可變區(qū)同時(shí)測序坐求，而且在測序速度和測序通量上都有進(jìn)一步提升，目前此平臺(tái)已在微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)研究方面受到了廣大學(xué)者的認(rèn)可晌梨。
第二代高通量測序技術(shù)
產(chǎn)品優(yōu)勢
無需培養(yǎng)分離菌群：
直接從環(huán)境樣本中擴(kuò)增核糖體RNA 高變區(qū)進(jìn)行測序桥嗤，解決了大部分菌株不可培養(yǎng)的難題。
客觀還原菌群結(jié)構(gòu)：
專業(yè)仔蝌、成熟泛领、穩(wěn)定的樣本制備流程，嚴(yán)格控制PCR 循環(huán)數(shù)敛惊，客觀還原樣品本身的菌群結(jié)構(gòu)及豐度比例渊鞋。
痕量菌檢測：
充分發(fā)揮高通量測序的大數(shù)據(jù)量優(yōu)勢，能檢測出豐度低至萬分之一的痕量菌瞧挤。
1. 稀釋性曲線（Rarefaction Curve）采用對測序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法锡宋，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建曲線，即稀釋性曲線皿伺。
當(dāng)曲線趨于平坦時(shí)员辩，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻(xiàn)很型遗浮奠滑；反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。
橫軸：從某個(gè)樣品中隨機(jī)抽取的測序條數(shù)妒穴；"Label 0.03" 表示該分析是基于OTU 序列差異水平在0.03宋税，即相似度為97% 的水平上進(jìn)行運(yùn)算的，客戶可以選取其他不同的相似度水平讼油。
縱軸：基于該測序條數(shù)能構(gòu)建的OTU數(shù)量杰赛。
曲線解讀：
? 圖1中每條曲線代表一個(gè)樣品，用不同顏色標(biāo)記矮台；
? 隨測序深度增加乏屯，被發(fā)現(xiàn)OTU 的數(shù)量增加根时。當(dāng)曲線趨于平緩時(shí)表示此時(shí)的測序數(shù)據(jù)量較為合理。
2. Shannon-Wiener 曲線
反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)辰晕，利用各樣品的測序量在不同測序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線蛤迎，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。
當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)含友，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大替裆，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。
橫軸：從某個(gè)樣品中隨機(jī)抽取的測序條數(shù)窘问。
縱軸：Shannon-Wiener 指數(shù)辆童，用來估算群落多樣性的高低。
Shannon 指數(shù)計(jì)算公式：
其中惠赫，
Sobs
= 實(shí)際測量出的OTU數(shù)目把鉴；
ni
= 含有i 條序列的OTU數(shù)目；
N = 所有的序列數(shù)儿咱。
曲線解讀：
? 圖2每條曲線代表一個(gè)樣品纸镊，用不同顏色標(biāo)記，末端數(shù)字為實(shí)際測序條數(shù)概疆；
? 起初曲線直線上升，是由于測序條數(shù)遠(yuǎn)不足覆蓋樣品導(dǎo)致峰搪；
? 數(shù)值升高直至平滑說明測序條數(shù)足以覆蓋樣品中的大部分微生物岔冀。
3.Rank-Abundance 曲線用于同時(shí)解釋樣品多樣性的兩個(gè)方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度概耻。
物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度來反映使套，曲線越寬，表示物種的組成越豐富鞠柄；
物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映侦高，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高厌杜。
橫軸：OTU 相對豐度含量等級(jí)降序排列奉呛。
縱軸：相對豐度比例。
曲線解讀：
? 圖3與圖4中每條曲線對應(yīng)一個(gè)樣本（參考右上角圖標(biāo)）夯尽；
? 圖3與圖4中橫坐標(biāo)表示的是OTU（物種）豐度排列順序瞧壮，縱坐標(biāo)對應(yīng)的是OTU（物種）所占相對豐度比例（圖3為相對百分比例，圖4為換算后Log值）匙握，曲線趨于水平則表示樣品中各物種所占比例相似咆槽；曲線整體斜率越大則表示樣品中各物種所占比例差異較大。
4. 樣本群落組成分析：多樣本柱狀圖/ 單樣本餅狀圖
根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果圈纺，可以得知一個(gè)或多個(gè)樣品在各分類水平上的物種組成比例情況秦忿，反映樣品在不同分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)麦射。
柱狀圖（圖5）
橫軸：各樣品的編號(hào)。
縱軸：相對豐度比例灯谣。
圖標(biāo)解讀：
? 顏色對應(yīng)此分類學(xué)水平下各物種名稱潜秋，不同色塊寬度表示不同物種相對豐度比例；
? 可以在不同分類學(xué)水平下作圖分析酬屉。
餅狀圖（圖6）
在某一分類學(xué)水平上半等，不同菌群所占的相對豐度比例。不同顏色代表不同的物種呐萨。
5. 樣品OTU 分布Venn 圖
用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣品中共有或獨(dú)有的OTU數(shù)目杀饵，可以比較直觀地表現(xiàn)各環(huán)境樣品之間的OTU 組成相似程度。
不同樣品用不同顏色標(biāo)記谬擦，各個(gè)數(shù)字代表了某個(gè)樣品獨(dú)有或幾種樣品共有的OTU 數(shù)量切距，對應(yīng)的OTU編號(hào)會(huì)以EXCEL 表的形式在結(jié)題報(bào)告中呈現(xiàn)。
分析要求
單張分析圖惨远，樣本分組至少兩個(gè)谜悟，最多5 個(gè)。
? 默認(rèn)設(shè)置為97% 相似度水平下以O(shè)TU 為單位進(jìn)行分析作圖北秽。
6. Heatmap 圖
用顏色變化來反映二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)信息葡幸，它可以直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來。將高豐度和低豐度的物種分塊聚集贺氓，通過顏色梯度及相似程度來反映多個(gè)樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性蔚叨。
相對豐度比例：
熱圖（圖8）中每小格代表其所在樣品中某個(gè)OTU 的相對豐度。以圖8為例辙培，紅框高亮的小格所對應(yīng)的信息為：樣本（R11-1Z）中OTU（OTU128）的相對豐度比例大概為0.2%蔑水。
豐度比例計(jì)算公式（Bray Curtis 算法）：
其中，SA,i
= 表示A樣品中第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)
SB,i
= 表示B樣品中第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)
樣品間聚類關(guān)系樹：
進(jìn)化樹表示在選用成圖數(shù)據(jù)中扬蕊，樣本與樣本間序列的進(jìn)化關(guān)系（差異關(guān)系）搀别。處于同一分支內(nèi)的樣品序列進(jìn)化關(guān)系相近。
物種/OTU 豐度相似性樹：
豐度相似性樹表示選用成圖的數(shù)據(jù)中樣品與樣品中的OTU 或序列在豐度上的相似程度尾抑。豐度最相近的會(huì)分配到同一分支上歇父。
客戶自定義分組：根據(jù)研究需求對菌群物種/OTU 研究樣本進(jìn)行二級(jí)分組
? 二級(jí)物種/OTU 分組：將下級(jí)分類學(xué)水平物種或OTU 分配到對應(yīng)的上級(jí)分類學(xué)水平，以不同顏色區(qū)分蛮穿；
? 二級(jí)樣品分組：根據(jù)研究需要庶骄，對樣品進(jìn)行人為的分組，以不同顏色區(qū)分践磅。
7. 主成分分析PCA (Principal Component Analysis)
在多元統(tǒng)計(jì)分析中单刁，主成分分析是一種簡化數(shù)據(jù)集的技術(shù)。主成分分析經(jīng)常用于減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)集中對方差貢獻(xiàn)最大的特征羔飞，從而有效地找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)肺樟，去除噪音和冗余，將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維逻淌，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡單結(jié)構(gòu)么伯。
通過分析不同樣品的OTU 組成可以反映樣品間的差異和距離，PCA 運(yùn)用方差分解卡儒，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上田柔，坐標(biāo)軸為能夠最大程度反映方差的兩個(gè)特征值。如樣品組成越相似骨望，反映在PCA圖中的距離越近硬爆。
橫軸和縱軸：以百分?jǐn)?shù)的形式體現(xiàn)主成分主要影響程度。以圖9為例擎鸠，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）是造成四組樣品（紅色缀磕，藍(lán)色，黃色和綠色）的兩個(gè)最大差異特征劣光，貢獻(xiàn)率分別為41.1% 和27.1%袜蚕。
十字交叉線：在圖9中作為0 點(diǎn)基線存在，起到輔助分析的作用绢涡，本身沒有意義牲剃。
圖例解讀：
? PCA 分析圖是基于每個(gè)樣品中所含有的全部OTU 完成的；
? 圖9中每個(gè)點(diǎn)代表了一個(gè)樣本雄可；顏色則代表不同的樣品分組颠黎；
? 兩點(diǎn)之間在橫、縱坐標(biāo)上的距離滞项，代表了樣品受主成分（PC1 或 PC2）影響下的相似性距離；
? 樣本數(shù)量越多夭坪，該分析意義越大文判；反之樣本數(shù)量過少，會(huì)產(chǎn)生個(gè)體差異室梅，導(dǎo)致PCA分析成圖后形成較大距離的分開戏仓，建議多組樣品時(shí)，每組不少于5個(gè)亡鼠，不分組時(shí)樣品不少于10個(gè)赏殃；
? 圖10中的圓圈為聚類分析結(jié)果，圓圈內(nèi)的樣品间涵，其相似距離比較接近仁热。
8. RDA/ CCA 分析圖
基于對應(yīng)分析發(fā)展的一種排序方法，將對應(yīng)分析與多元回歸分析相結(jié)合勾哩，每一步計(jì)算均與環(huán)境因子進(jìn)行回歸抗蠢，又稱多元直接梯度分析举哟。主要用來反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系。RDA 是基于線性模型迅矛，CCA是基于單峰模型妨猩。分析可以檢測環(huán)境因子、樣品秽褒、菌群三者之間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系壶硅。
橫軸和縱軸：RDA 和CCA 分析，模型不同销斟，橫縱坐標(biāo)上的刻度為每個(gè)樣品或者物種在與環(huán)境因子進(jìn)行回歸分析計(jì)算時(shí)產(chǎn)生的值庐椒，可以繪制于二維圖形中。
圖例解讀：
? 冗余分析可以基于所有樣品的OTU作圖票堵，也可以基于樣品中優(yōu)勢物種作圖扼睬；
? 箭頭射線：圖11中的箭頭分別代表不同的環(huán)境因子（即圖中的碳酸氫根離子HCO3-，醋酸根離子AC-等悴势，圖中的其它環(huán)境因子因研究不同代表的意義不同窗宇，因此不再贅述）；
? 夾角：環(huán)境因子之間的夾角為銳角時(shí)表示兩個(gè)環(huán)境因子之間呈正相關(guān)關(guān)系特纤，鈍角時(shí)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系军俊。環(huán)境因子的射線越長亥啦，說明該影響因子的影響程度越大缎岗；
? 圖11中不同顏色的點(diǎn)表示不同組別的樣品或者同一組別不同時(shí)期的樣品，圖中的拉丁文代表物種名稱殿托，可以將關(guān)注的優(yōu)勢物種也納入圖中昔穴；
? 環(huán)境因子數(shù)量要少于樣本數(shù)量镰官，同時(shí)在分析時(shí)，需要提供環(huán)境因子的數(shù)據(jù)吗货，比如 pH值泳唠，測定的溫度值等。
9. 單樣品/ 多樣品分類學(xué)系統(tǒng)組成樹
根據(jù)NCBI 提供的已有微生物物種的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫宙搬，將測序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫的分類學(xué)系統(tǒng)關(guān)系樹中笨腥，從整個(gè)分類系統(tǒng)上全面了解樣品中所有微生物的進(jìn)化關(guān)系和豐度差異。
單樣品圖（圖12）：可以了解單樣品中的序列在各個(gè)分類學(xué)水平上的分布情況勇垛。
圖例解讀：
? 圖12中不同的層次反映不同的分類學(xué)水平脖母；
? 分支處的圓面積說明了分布在該分類學(xué)水平，且無法繼續(xù)往下級(jí)水平比對的序列數(shù)量闲孤，面積越大谆级，說明此類序列越多；
? 每個(gè)分支上的名詞后面的兩組數(shù)字分別表示比對到該分支上的序列數(shù)和駐留在該節(jié)點(diǎn)上的序列數(shù)；
? 圖13中為某單一水平物種分布情況哨苛，并非是序列分布鸽凶。
多樣品圖（圖14）：比對多個(gè)樣品在不同分類學(xué)分支上序列數(shù)量差異。
圖例解讀：
? 比對不同樣品在某分支上的序列數(shù)量差異建峭，通過帶顏色的餅狀圖呈現(xiàn)玻侥，餅狀圖的面積越大，說明在分支處的序列數(shù)量越多亿蒸，不同的顏色代表不同的樣品凑兰。
? 某顏色的扇形面積越大，說明在該分支上边锁，其對應(yīng)樣品的序列數(shù)比其他樣品多姑食。
? 多樣品在做該分析時(shí)，建議樣品數(shù)量控制在10個(gè)以內(nèi)茅坛，或者將重復(fù)樣本數(shù)據(jù)合并成一個(gè)樣本后音半，總樣品數(shù)在10個(gè)以內(nèi)。
10.系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹
在分子進(jìn)化研究中贡蓖，基于系統(tǒng)發(fā)生的推斷來揭示某一分類水平上序列間堿基的差異曹鸠，進(jìn)而構(gòu)建進(jìn)化樹。
圖例解讀：
? 圖15中體現(xiàn)的是序列進(jìn)化差異情況斥铺，處在同一分支上的物種說明進(jìn)化關(guān)系較近彻桃。
? 圖15左下角的圖例為距離標(biāo)尺，分支距離越長晾蜘，進(jìn)化關(guān)系越遠(yuǎn)邻眷。
11. (un)Weighted UniFrac PCoA/Tree 分析
利用各樣品序列間的進(jìn)化信息來計(jì)算樣品間距離，反映環(huán)境樣品在進(jìn)化樹中是否有顯著的微生物群落差異剔交。
PCoA（principal co-ordinates analysis）是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法肆饶，通過一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值岖常，PCoA 可以找到 距離矩陣中最主要的坐標(biāo)抖拴，結(jié)果是數(shù)據(jù)矩陣的一個(gè)旋轉(zhuǎn)，它沒有改變樣品點(diǎn)之間的相互位置關(guān)系腥椒，只是改變了坐標(biāo)系統(tǒng)。通過PCoA 可以觀察個(gè)體或群體間的差異候衍。
圖例解讀：
? 圖16和圖17中不同顏色代表不同分組笼蛛；
? PCoA 分析建議不分組時(shí)，樣本數(shù)量不少于10 個(gè)蛉鹿；多組樣本時(shí)滨砍，每組樣本數(shù)量不少于5 個(gè)；
? 對于某一功能基因，進(jìn)行進(jìn)化樹分析時(shí)惋戏，建議采用OTU數(shù)目控制在10,000以內(nèi)领追，或者由客戶指定分析優(yōu)勢OTU個(gè)數(shù)。
12. NMDS 分析
NMDS（Nonmetric Multidimensional Scaling）常用于比對樣本組之間的差異响逢，可以基于進(jìn)化關(guān)系或數(shù)量距離矩陣绒窑。
橫軸和縱軸：表示基于進(jìn)化或者數(shù)量距離矩陣的數(shù)值在二維表中成圖。
圖例解讀：
? 圖18中不同的顏色代表不同的分組舔亭；
? 建議不分組時(shí)些膨，樣本數(shù)量不少于10個(gè)；多組樣本時(shí)钦铺，每組樣本數(shù)量不少于5個(gè)订雾；
? 圖18中的點(diǎn)代表樣本，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離表示差異程度矛洞。
13. 含相似性樹柱狀圖
根據(jù)樣品中相似程度進(jìn)行排布洼哎，并繪制對應(yīng)樣本樹狀圖反映樣本中群落結(jié)構(gòu)。
圖例解讀：
? 圖19中左側(cè)是相似度樹狀圖沼本，樣本之間的差異越小噩峦，樣本便會(huì)處在相近的同一分支上；
? 右側(cè)柱狀圖擅威，展示樣本中微生物的群落結(jié)構(gòu)壕探。不同顏色代表不同物種。
14.Unifrac 顯著性差異分析
比較樣品間進(jìn)化差異的顯著性分析郊丛。
圖例解讀：
? 圖20橫坐標(biāo)為兩組樣品李请；
? 縱軸坐標(biāo)為unifrac 進(jìn)化距離（序列差異）。
15. 單因素unweighted unifrac PCA 分析
在某單一因素上厉熟，進(jìn)行unweighted unifrac PCA 分析导盅。
圖例解讀：
? 圖21橫軸為不同變量（本例為不同年齡階段）下的樣本；
? 縱坐標(biāo)為主成分揍瑟，圖21中顯示同一年齡階段內(nèi)和不同年齡階段間的由主成分導(dǎo)致的差異情況白翻。
16. 個(gè)性化分析案例展示
案例描述一
Community composition of root-associated fungi in a Quercus-dominated temperate forest:"codominance" of mycorrhizal and root-endophytic fungi. Ecol Evol. 2013 May; 3(5):1281-93.
樣本來源
樣本數(shù)量
高變區(qū)
測序平臺(tái)
測序量（reads）
植物根系/ 泥土
159/38
ITS
Roche GS
70,495
樣本來自于以日本橡木為主的溫帶森林，使用454 測序分析多個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的真菌多樣性绢片。樣品來源為植物根系樣本滤馍，從12 株植物中提取了159 份根系。分析結(jié)果表明底循，外生真菌群落和根系內(nèi)生真菌群落互相作用巢株，維持了這種以日本橡木為主的溫帶森林的生態(tài)環(huán)境。
圖例解讀：
? 圖22構(gòu)建了地下植物與真菌的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)熙涤；
? 圖22中灰色圓點(diǎn)表示與植物共生的微生物物種阁苞，菱形代表真菌OTU困檩，它們之間的關(guān)系用灰色連接線表示；
? 它們之間的密集程度越高表示它們之間相互作用被觀察的次數(shù)越多那槽；
? 互利共生真菌OTU 用粉色菱形表示悼沿；寄生微生物OTU用橘色菱形表示；未知功能OTU用藍(lán)色菱形表示骚灸；
? A：子囊真菌門糟趾；B：擔(dān)子菌門；G：球囊菌門逢唤；U：表示門水平未知真菌拉讯。
案例描述二
The ignored diversity: complex bacterial communities in intensive care units revealed by 16S pyrosequencing. Sci Rep. 2013;3:1413.
室內(nèi)微生物群落對日常生活中人類健康起著重要作用，尤其是醫(yī)院的重癥監(jiān)護(hù)室鳖藕。采用擴(kuò)增焦磷酸測序研究ICU 中微生物群落可以檢測多種微生物序列魔慷，與現(xiàn)有的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)相比，有極大的優(yōu)越性著恩。
傳統(tǒng)培養(yǎng)方式只能檢測總細(xì)菌多樣性的2.5％院尔。結(jié)合外部環(huán)境與物種系統(tǒng)發(fā)育譜分析發(fā)現(xiàn)，許多微生物與潛在的人類病原菌相關(guān)喉誊，當(dāng)然也包含有益菌邀摆，一共7 個(gè)門76 個(gè)屬。此外伍茄，丙酸桿菌屬栋盹，假單孢菌屬和伯克霍爾德氏菌被確定為感染的重要來源。在地板敷矫，醫(yī)療器械和工作間微生物組成有顯著差異例获，但網(wǎng)絡(luò)分析和一致性分子指紋印記分析發(fā)現(xiàn)該三個(gè)地點(diǎn)微生物組成也有一定的相似性。這些信息將幫助加護(hù)病房進(jìn)行新的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)評估曹仗，幫助建立新的衛(wèi)生協(xié)議榨汤，幫助深入了解醫(yī)院獲得性感染的情況。
樣本來源
樣本數(shù)量
高變區(qū)
測序平臺(tái)
測序量（reads）
重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）中地板怎茫，醫(yī)療設(shè)備及工作間表面樣品
34
16S rRNA
Roche 454 FLX+
5000/樣本
圖23為豐度最高的40 種菌(OTU) 在不同采樣區(qū)域的分布情況收壕。不同顏色代表不同樣本來源，綠色為ICU 地板轨蛤，紅色為醫(yī)療設(shè)備蜜宪，藍(lán)色為工作間。結(jié)點(diǎn)面積表示該OTU 在三個(gè)采樣區(qū)域之間的相對豐度祥山。
案例描述三
Skin Microbiome Imbalance in Patients with STAT1/STAT3 Defects Impairs Innate Host Defense Responses. Journal of Innate Immunity. 2013, DOI: 10.1159/000351912.
CMC和HIES均屬于罕見的原發(fā)性免疫缺陷病圃验。本文研究了CMC和HIES病人皮膚及口腔微生物與正常人群的微生物菌群差異。結(jié)果表明枪蘑，相比正常人體的微生物組成（主要包括棒桿菌屬和放線菌科等）损谦，病人的所攜帶的微生物中革蘭氏陰性菌比例增加。而革蘭氏陰性菌（如不動(dòng)桿菌屬）可以抑制機(jī)體對假絲酵母和金色葡萄球菌的免疫反應(yīng)岳颇，結(jié)果很可能導(dǎo)致患者對這些菌感染的敏感性增加照捡。本文的研究表明，此類免疫缺陷病人所攜帶的微生物菌群可以影響宿主的免疫防御系統(tǒng)话侧，進(jìn)而有可能通過基于微生物的輔助療法來治療免疫缺陷的患者栗精。
樣本來源
樣本數(shù)量
高變區(qū)
測序平臺(tái)
測序量（reads）
慢性皮膚黏膜念珠菌病（CMC）瞻鹏、高IgE綜合癥（HIES）患者皮膚及口腔微生物
60
16S rRNA
V4區(qū)
MiSeq
6389/樣 本
圖24 為免疫缺陷疾病各亞型患者皮膚和口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的協(xié)方差悲立。（a）圖表示35個(gè)皮膚樣本的微生物多樣性的差異；（b）圖表示21個(gè)口腔樣本微生物多樣性差異新博。其中薪夕，綠色方塊表示健康對照組，紅色圓圈表示CMC赫悄，藍(lán)色三角形表示HIES原献。健康人體皮膚表面的微生物主要包括葡萄球菌和棒狀桿菌，而疾病組多為莫拉菌科埂淮。
境微生物多樣性分析-基礎(chǔ)
常見問題
Q1.能對哪些環(huán)境下的樣品進(jìn)行分析姑隅？**A **目前已經(jīng)成功運(yùn)用Roche 454技術(shù)發(fā)表的文章涵蓋農(nóng)業(yè)、土壤倔撞、林業(yè)讲仰、海洋、礦井（石油等）痪蝇、人體醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域鄙陡，共計(jì)近1400篇，Paper目錄可向本公司索取霹俺。其中有大量文獻(xiàn)發(fā)表于國際頂級(jí)雜志上柔吼，包括Science、Nature丙唧、ISME愈魏、PNAS、AEM等想际。
Q2. DGGE技術(shù)與Roche 454高通量測序技術(shù)在環(huán)境微生物群落多樣性研究中有什么區(qū)別培漏？
A DGGE等分子指紋圖譜技術(shù)，在其實(shí)驗(yàn)結(jié)果中往往只含有數(shù)十條條帶胡本，只能反映出樣品中的優(yōu)勢種群牌柄，也無法得到細(xì)菌種類及其絕對含量。而Roche 454高通量測序技術(shù)能同時(shí)對樣品中的優(yōu)勢種群及微量菌進(jìn)行檢測侧甫，獲得樣品中的微生物群落組成珊佣，并將其含量進(jìn)行數(shù)字化蹋宦。
Q3. 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有哪些應(yīng)用？
**A **在人類的皮膚咒锻、口腔冷冗、呼吸道、胃腸道和尿道等處存在著大量與人體健康密切相關(guān)的正常菌群惑艇。它們能夠合成并輔助機(jī)體吸收一些必需氨基酸和維生素蒿辙；加工諸如植物多糖等人類飲食中一些難以消化的組分；占據(jù)人體的不同粘膜表面并產(chǎn)生天然的抗生素滨巴，抑制有害菌的著落與生長思灌。目前，人們已經(jīng)采用傳統(tǒng)方法對人人體微生物作了許多研究恭取，但是這種方法需要對微生物進(jìn)行純培養(yǎng)泰偿，從而大大限制了我們對機(jī)體正常菌群，尤其是許多不可培養(yǎng)微生物的認(rèn)識(shí)秽荤。第二代高通量測序技術(shù)能對人體菌群進(jìn)行深度測序甜奄，從而精確檢測到千分之一機(jī)體微生物群落的數(shù)量和組成結(jié)構(gòu)的變化，突破了傳統(tǒng)方法基于純培養(yǎng)的限制窃款，能使我們從整體上認(rèn)識(shí)微生物群落與宿主之間的相互關(guān)系及其對人體健康的影響课兄。例如，利用第二代高通量測序技術(shù)可以對處于疾病狀態(tài)下的人體微生境進(jìn)行研究晨继，比較分析正常和疾病狀態(tài)下或疾病不同進(jìn)程人體微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能變化烟阐；可以對正常人群與某些疾病患者體內(nèi)的微生物群體多樣性進(jìn)行比較分析，研究微生物群落變化同疾病之間的關(guān)系紊扬；通過深度測序還可以快速地發(fā)現(xiàn)和檢測常見病原及新發(fā)傳染病病原微生物蜒茄。
Q4. 高通量測序是否需要做平行樣？
**A **隨著高通量測序的發(fā)展餐屎，提出研究過程中設(shè)置重復(fù)樣的要求檀葛，也日益被大家所接受。在高通量研究中腹缩，設(shè)置重復(fù)樣不僅僅是體現(xiàn)了科研的一種嚴(yán)謹(jǐn)態(tài)度屿聋，同時(shí)也體現(xiàn)了結(jié)果的真實(shí)性，避免了個(gè)體差異造成的影響藏鹊。
目前的發(fā)展趨勢：普通樣品（水體润讥，土壤，處理樣本內(nèi)部設(shè)置重復(fù)等）一般會(huì)要求設(shè)置重復(fù)樣盘寡；對于大面積研究水體和土壤等樣本時(shí)楚殿，可以采用多點(diǎn)采樣混樣研究。稀有樣本（稀有動(dòng)物糞便竿痰，冰川極地冰樣脆粥，過多采樣會(huì)影響整體環(huán)境構(gòu)成的樣本等）對于重復(fù)樣設(shè)置的要求相對比較寬松砌溺。
Q5. 454一塊PTP板最多可以放多少樣本？1個(gè)相同的樣本分別研究細(xì)菌变隔，真菌抚吠，古菌是否可以放在同一塊PTP板上測序？
A理論上弟胀，知道每個(gè)樣本的測序量和一個(gè)454PTP板能夠容納的測序量，便能得知可以測序的樣本量喊式。實(shí)際上孵户，考慮到測序質(zhì)量的因素，不可如此計(jì)算上樣量岔留。一塊PTP能夠容納多少樣本往往應(yīng)該考慮以下兩個(gè)因素：
- barcode數(shù)量：barcode是用于區(qū)分上樣樣品的標(biāo)簽序列夏哭，標(biāo)簽的個(gè)數(shù)限制著一塊PTP能夠容納多少樣本；
- PTP板分區(qū)情況：PTP板分區(qū)越多可以增加上樣的樣品個(gè)數(shù)献联，但分區(qū)越多竖配，會(huì)影響測序總量。
一塊PTP板里逆，在不分區(qū)的情況下进胯，一般可以產(chǎn)出80萬條序列，綜合考慮barcode數(shù)量原押，分區(qū)情況以及單樣本的測序量胁镐，便可計(jì)算一塊PTP板容納的樣本數(shù)量。
對于同一個(gè)樣本诸衔，分別研究細(xì)菌盯漂，真菌，古菌一般是可以放到同一個(gè)板里進(jìn)行測序笨农，但要考慮到不同類型PCR產(chǎn)物的長度對測序結(jié)果的影響就缆，如果PCR產(chǎn)物長度差異較大，則不可以放入同一塊PTP板進(jìn)行測序谒亦。
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