你所要知道的宏基因組關(guān)聯(lián)分析知識(shí)都在這里
Nature于今年7月6日緊隨Science4月29日的特刊邪驮，推出業(yè)內(nèi)頂級(jí)專家主筆的6篇有關(guān)“腸道菌群-宿主相互作用”的重量級(jí)綜述和觀點(diǎn)透視專輯猎莲，提供了腸道菌群在多個(gè)領(lǐng)域的和臨床應(yīng)用發(fā)展中的重要進(jìn)展推溃。本期專輯的推出沿盅，為腸道菌群和腸道健康的研究和轉(zhuǎn)化再一次搖旗吶喊戳护。宏基因組關(guān)聯(lián)分析（MWAS）作為微生物組研究的一把利器婉刀，正在微生物與疾病研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用匀钧。今天小銳說(shuō)事兒便跟大家聊聊6篇雄文中的一篇來(lái)自微生物研究領(lǐng)域大牛Jack A. Gilbert（美國(guó)環(huán)境、醫(yī)院和家庭微生物組計(jì)劃發(fā)起人冗茸，點(diǎn)擊名字查看教授簡(jiǎn)介）主筆的綜述文章席镀，有關(guān)宏基因組關(guān)聯(lián)分析在疾病領(lǐng)域的研究進(jìn)展。文章主旨本綜述總結(jié)了疾病相關(guān)生物學(xué)過(guò)程中微生物的作用夏漱，并詳細(xì)介紹了宏基因組關(guān)聯(lián)分析（MWAS）方法以及它在關(guān)聯(lián)微生物與疾病表型中的研究成果豪诲。MWAS與GWAS的異同點(diǎn)從概念上來(lái)說(shuō)，宏基因組關(guān)聯(lián)分析（MWAS）與全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）的確有共同點(diǎn)挂绰，都是將某些復(fù)雜的特征（比如物種或基因）與表型關(guān)聯(lián)起來(lái)屎篱。但是，這兩者之間存在以下幾個(gè)非常重要的區(qū)別：第一葵蒂，微生物中的基因數(shù)量與人的基因數(shù)量比值接近100:1交播；第二，幾乎所有的個(gè)體都具有相同的基因践付，但所攜帶的微生物種類和基因差異巨大秦士；第三，人體的基因表達(dá)量很容易計(jì)算永高，而大部分微生物組數(shù)據(jù)只能通過(guò)相對(duì)豐度進(jìn)行量化隧土。因此，微生物組分析很有難度命爬；第四曹傀，人體基因組是不會(huì)改變的（除癌癥等特殊情況），而個(gè)體所攜帶的微生物組在不斷變化饲宛〗杂洌快速了解MWAS1.MWAS能夠?qū)⑽锓N注釋到種水平，對(duì)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)及功能注釋，另外還有少部分轉(zhuǎn)錄本和蛋白相關(guān)的分析幕庐。2.宏基因組測(cè)序和組裝為確保樣品間的比較有意義久锥，首先應(yīng)保證足夠測(cè)序數(shù)據(jù)量，因?yàn)楸粰z測(cè)到的基因數(shù)會(huì)隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加而增加翔脱，直到飽和奴拦。與從腸粘膜、口腔届吁、皮膚错妖、陰道和胎盤這些部位采集的樣品相比，糞便樣品宿主污染比較少疚沐，不超過(guò)總數(shù)據(jù)量的1%暂氯。經(jīng)過(guò)質(zhì)控，測(cè)序得到的序列（reads）被重新組裝成更長(zhǎng)的序列（contigs）亮蛔，這些contigs共同組成宏基因組痴施。3.微生物參考基因集通過(guò)對(duì)組裝后的contigs進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，并去除樣品間高度相似的基因序列究流，得到非冗余基因集辣吃。基因的豐度芬探、分類和功能都是基于這個(gè)參考基因集而被量化神得，從而進(jìn)行微生物與疾病之間的關(guān)系研究。因此偷仿，建立一個(gè)高質(zhì)量的參考基因集是MWAS的基礎(chǔ)哩簿。4.基于宏基因組數(shù)據(jù)的分類不同樣品中來(lái)自相同微生物基因組的一類基因應(yīng)該具有相同的豐度變化模式，可根據(jù)這一原理對(duì)宏基因組數(shù)據(jù)集中的基因進(jìn)行聚類酝静，將物種分辨率提高到菌株水平节榜。基于不同的相關(guān)系數(shù)和算法别智，這些聚類方法包括建立MLG（metagenomic linkage groups）宗苍、MGC（metagenomic clusters）或MGS（metagenomic species）。在物種注釋時(shí)薄榛，基于保守的單拷貝基因和基因組的菌株特異性區(qū)域進(jìn)行比對(duì)非常有效讳窟。例如，宏基因組操作分類單元法（mOTU）就是基于十個(gè)保守的單拷貝基因進(jìn)行物種注釋蛇数，因此，比利用16S rDNA在物種比對(duì)上更準(zhǔn)確是越。5.MWAS對(duì)微生物組的分析是基于整體的概念耳舅，采取降維的思想，將多維因素下數(shù)據(jù)的差異展示在二維坐標(biāo)上。一般通過(guò)聚類分析浦徊、主坐標(biāo)分析（PCoA）馏予、主成分分析（PCA）、一致性分析盔性、因子分析和判別分析來(lái)實(shí)現(xiàn)降維霞丧。
微生物在疾病領(lǐng)域研究進(jìn)展MWAS是通過(guò)研究特定環(huán)境中的微生物將疾病與微生物關(guān)聯(lián)起來(lái)。那目前疾病領(lǐng)域微生物研究進(jìn)展如何冕香？我們一起來(lái)回顧一下蛹尝。微生物標(biāo)記物現(xiàn)在大部分的研究都是通過(guò)鑒定微生物群落結(jié)構(gòu)的改變來(lái)區(qū)分患病風(fēng)險(xiǎn)人群與健康人。（1）微生物多樣性分析很多疾病研究都是基于微生物群落的相似性來(lái)區(qū)分不同的樣品悉尾。然而突那，度量標(biāo)準(zhǔn)，如統(tǒng)計(jì)學(xué)模型的選擇對(duì)結(jié)果的影響很少受到重視构眯。對(duì)于一組特征多樣化的樣品愕难，例如，來(lái)源于不同人群的皮膚樣品惫霸，即使通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)模型能夠揭示原始數(shù)據(jù)的差異猫缭，但很有可能這種差異與生物學(xué)上的差異不一致。另外壹店，從微生物復(fù)雜的潛在作用關(guān)系中提取出與研究相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要猜丹。比如鑒定出克羅恩病患者體內(nèi)有益和有害的微生物相互作用關(guān)系。但這種方法存在兩個(gè)問(wèn)題：第一茫打，通過(guò)多項(xiàng)分布得到的個(gè)別微生物的富集會(huì)產(chǎn)生很多負(fù)相關(guān)關(guān)系居触，從而引起網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的偏好性；第二老赤，分類數(shù)據(jù)非常稀少轮洋，某個(gè)特定微生物在大部分樣品中沒(méi)有富集。在物種注釋方面抬旺，宏基因組學(xué)比擴(kuò)增子測(cè)序更精確弊予。不過(guò)，通過(guò)寡核苷酸配型技術(shù)（oligotyping）對(duì)16S rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析开财，能夠提高物種鑒定的分辨率汉柒。然而，不是分辨率越高分類結(jié)果就越準(zhǔn)確责鳍，比如16S rDNA分析中分類到種水平的OTU在區(qū)分胖人與瘦人時(shí)的準(zhǔn)確性反而有所降低碾褂。（2）功能分析宏基因組學(xué)通過(guò)對(duì)特定環(huán)境中所有的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，故能夠提供更完整的微生物群落信息以及很多更強(qiáng)大的分析历葛。比如對(duì)物種的鑒定到菌株水平或單核苷酸多態(tài)性(SNPs)正塌，基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)嘀略、COG (Clusters of Orthologous Groups of Proteins)、GO (Gene Ontology)和EggNOG (Evolutionary Genealogy of Genes: Non-supervised Orthologous Groups)等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DNA序列進(jìn)行功能聚類乓诽。結(jié)合人類宏基因組與代謝組學(xué)數(shù)據(jù)在區(qū)分不同疾病特征方面很有優(yōu)勢(shì)（圖2）帜羊，除了能夠提高物種鑒定的分辨率，也有助于揭示某現(xiàn)象的潛在機(jī)理鸠天，比如解釋糞菌移植艱難梭菌如何改變小鼠膽汁酸代謝產(chǎn)物的研究讼育。宏蛋白質(zhì)組學(xué)也可以鑒定新的生物標(biāo)記物，已有報(bào)道稱乳酸脫氫酶稠集、精氨酸脫亞胺酶以及參與胞外多糖合成奶段、鐵代謝和免疫應(yīng)答過(guò)程中的酶，能夠作為健康人口腔環(huán)境中的標(biāo)記物巍杈。結(jié)合宏基因組學(xué)忧饭、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)揭示出微生物如何應(yīng)對(duì)特定的疾病狀態(tài)，比如IBD筷畦，并找到參與丁酸鹽和膽汁酸代謝過(guò)程中的特定物種（例如Faecalibacterium词裤、prausnitzii）、蛋白和代謝產(chǎn)物鳖宾，這些均可作為區(qū)分克羅恩病引起的回腸炎癥吼砂、結(jié)腸炎癥以及健康人腸道的生物標(biāo)記物。
圖2. 人類微生物組的代謝產(chǎn)物來(lái)源
MWAS在微生物-疾病研究中的成果表1. 宏基因組關(guān)聯(lián)分析在疾病領(lǐng)域的研究成果
從相關(guān)關(guān)系到因果關(guān)系想要明確疾病的發(fā)病機(jī)理鼎文，僅停留在微生物與疾病的相關(guān)關(guān)系上遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠渔肩。到目前為止，最大的挑戰(zhàn)就是超越微生物與疾病狀態(tài)的相關(guān)性拇惋，建立它們之間的因果關(guān)系周偎。case–control模型的限制就是不能確認(rèn)是微生物群落的變化引起疾病，還是疾病引起了微生物群落變化撑帖，又或是這兩者作為混合因素引起了兩者狀態(tài)的改變祟绊。目前的幾個(gè)用于鑒定微生物與疾病因果關(guān)系的研究方法均存在優(yōu)勢(shì)與缺陷毁渗∷夂福縱向研究停做，比如CHILD（Canadian Healthy Infant Longitudinal Development）出生隊(duì)列研究，能夠檢測(cè)微生物的變化在疾病發(fā)生之前還是之后衷敌，然而這項(xiàng)研究非常昂貴勿侯，且需要大量的人群樣本。干預(yù)研究可以通過(guò)藥物管理或其它干預(yù)方式來(lái)引起微生物和疾病表型的改變缴罗，這種方法非常有效助琐，但存在倫理問(wèn)題。比如糞菌移植就面臨很多障礙面氓，尤其在美國(guó)兵钮。另外沟堡，人群樣本很難采集，并存在很多隱私問(wèn)題矢空，特別是有些樣本被用于很多不同的研究。動(dòng)物模型雖然在探究疾病發(fā)生機(jī)理方面有很大的應(yīng)用價(jià)值禀横，但這些機(jī)理與人類疾病之間的關(guān)系還有待明確屁药。代謝組揭示重要的微生物活動(dòng)由于代謝過(guò)程的變化非常快柏锄，能夠同時(shí)揭示出宿主和微生物的生理狀態(tài)酿箭，代謝組生物標(biāo)記物在疾病診斷方面具有重要作用。人體微生物組所產(chǎn)生的小分子由四組構(gòu)成趾娃。第一組是分解代謝和合成代謝產(chǎn)生的初級(jí)代謝物缭嫡，主要用于細(xì)胞生長(zhǎng)和維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。第二組包含一些特定代謝物抬闷，包括毒力因子妇蛀、二級(jí)代謝物和自然產(chǎn)物。研究二級(jí)代謝物的變化可以幫助人們理解食物中的毒素笤成、群體感應(yīng)和有益的代謝物评架。第三組是宿主產(chǎn)生的代謝物或受到微生物酶修飾而產(chǎn)生的化學(xué)產(chǎn)品。研究第三組代謝物的變化炕泳，有助于理解微生物如何影響宿主的代謝產(chǎn)物纵诞。第四組是個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、藥物干預(yù)培遵、食物或外界環(huán)境作用下所產(chǎn)生的化學(xué)過(guò)程和代謝產(chǎn)物浙芙。研究第四組代謝物的變化有利于理解這些化合物是怎樣作用于機(jī)體從而引起有害反應(yīng)或其它形式的變化。越來(lái)越多的研究表明微生物的代謝物能夠直接影響人體健康籽腕，例如 SCFAs（短鏈脂肪酸）對(duì)IBD發(fā)生嗡呼、發(fā)展的影響。MassBank节仿、METLIN晤锥、MetaboLights和HMDB（the Human Metabolome Database，人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)）等數(shù)據(jù)庫(kù)依次出現(xiàn)廊宪，旨在儲(chǔ)存和傳播質(zhì)譜分析獲得的數(shù)據(jù)矾瘾，使得更多代謝物被注釋。無(wú)菌動(dòng)物的使用在鑒定宿主微生物所產(chǎn)生的初級(jí)代謝物中具有重要作用箭启，但很多代謝物在人類健康中的作用還有待研究壕翩。另外，微生物的致病要素可能是編碼特定代謝物的基因傅寡，而非致病物種的核心基因（圖2）放妈。因此北救，微生物相關(guān)疾病的研究也可以從研究這些基因的角度出發(fā)。值得一提的是芜抒，除了宏基因組和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)珍策，宏轉(zhuǎn)錄組、環(huán)境蛋白質(zhì)組可通過(guò)研究疾病人群微生物中顯著富集的RNAs和蛋白質(zhì)進(jìn)一步為微生物-疾病之間的關(guān)系提供依據(jù)宅倒。人體腸道菌群在對(duì)藥物功效和毒性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用攘宙。個(gè)體微生物的差異使得個(gè)體服藥后所引起的代謝不同從而導(dǎo)致個(gè)體間有效藥物劑量和副作用的不同。在服用伊立替康治療結(jié)腸癌的病人中拐迁，40%病人的治療療效因微生物相關(guān)的藥物毒性而降低蹭劈。研究發(fā)現(xiàn)，這種藥物毒性產(chǎn)生與一種微生物的β-葡萄糖醛酸酶相關(guān)线召，目前通過(guò)抑制這種酶來(lái)調(diào)節(jié)微生物活性的抑制劑正處于臨床實(shí)驗(yàn)階段铺韧。因此，為全面理解人體微生物組在健康和疾病中的作用缓淹，多組學(xué)工具的應(yīng)用非常重要哈打。什么是健康的微生物組與疾病人群相比，宏基因組關(guān)聯(lián)分析在健康人中鑒定出的細(xì)菌種類和功能能夠作為一個(gè)健康的微生物組的部分特征（表1）讯壶。其中前酿，產(chǎn)生短鏈脂肪酸的細(xì)菌，如R. inulinivorans和F. prausnitzii在很多疾病相對(duì)應(yīng)的健康人樣本中均發(fā)生富集鹏溯，包括II型糖尿病和肥胖罢维。擬桿菌屬的微生物在順產(chǎn)和母乳喂養(yǎng)嬰兒中豐度最高，而在很多健康人和疾病人群中也顯著富集丙挽。一方面肺孵，擬桿菌屬的細(xì)菌能夠幫助代謝植物中的糖，給宿主提供營(yíng)養(yǎng)颜阐；另一方面平窘，這些細(xì)菌也會(huì)產(chǎn)生毒素，這可能對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)展產(chǎn)生影響凳怨。同樣地瑰艘，盡管Lactobacillussa livarius和Bifidobacterium dentium被認(rèn)為是對(duì)免疫系統(tǒng)有益的物種，但在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)菌顯著富集肤舞。因此紫新，對(duì)這些物種在菌株水平進(jìn)行鑒定，有助于闡明它們?cè)谌祟惣膊∨c健康中看似矛盾的作用李剖。與在物種分類水平相比芒率，健康人和疾病人群的分類依據(jù)在功能水平更明確。在腸道的缺氧環(huán)境中篙顺，抗氧化應(yīng)激能力的增強(qiáng)標(biāo)志著腸道菌群失衡偶芍，同時(shí)也表示好氧細(xì)菌的增加或者宿主免疫系統(tǒng)被激活充择。另一個(gè)腸道菌群失調(diào)的標(biāo)志是硫酸鹽或亞硫酸鹽向硫氰化物的轉(zhuǎn)換。從某種程度上來(lái)說(shuō)匪蟀，短鏈脂肪酸丁酸鹽和丙酸鹽等代謝物是腸道上皮細(xì)胞能量的主要來(lái)源椎麦，能夠幫助維持一個(gè)健康的腸道環(huán)境，如MWAS參與的II型糖尿病材彪、肥胖和結(jié)腸癌腸道菌群研究铃剔。發(fā)展一個(gè)微生物全球定位系統(tǒng)
圖3. 微生物全球定位系統(tǒng)對(duì)疾病人群的分層以及指導(dǎo)其治療
未來(lái)基于MWAS技術(shù)對(duì)微生物組在相關(guān)疾病中作用的研究會(huì)越來(lái)越深入，科學(xué)家們希望能夠發(fā)展一個(gè)微生物全球定位系統(tǒng)來(lái)對(duì)疾病人群進(jìn)行分層查刻，指導(dǎo)精準(zhǔn)醫(yī)療，從而維護(hù)人類健康（圖3）凤类。參 考 文 獻(xiàn)[1] Qin, J. et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes. Nature 490,55–60 (2012).[2] Karlsson, F. H. et al. Gut metagenome in European women with normal, impaired and diabetic glucose control. Nature 498, 99–103 (2013).[3] Forslund, K. et al. Disentangling type 2 diabetes and metformin treatment signatures in thehuman gut microbiota. Nature 528, 262–266 (2015).[4]Karlsson, F. H. et al. Symptomatic atherosclerosis is associated with an altered gut metagenome. Nat. Commun. 3, 1245 (2012).[5] Le Chatelier, E. et al. Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers.Nature 500, 541–546 (2013).[6] Cotillard, A. et al. Dietary intervention impact on gut microbial gene richness. Nature 500, 585–588 (2013).[7] Qin, N. et al. Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis. Nature 513, 859–864 (2014).[8] Zeller, G. et al. Potential of fecal microbiota for earlystage detection of colorectal cancer. Mol. Syst. Biol.10, 766 (2014).[9] Feng, Q. et al. Gut microbiome development along the colorectal adenoma–carcinoma sequence. Nat. Commun. 6, 6528 (2015).[10] Yu, J. et al. Metagenomic analysis of faecal microbiome as a tool towards targeted non-invasive biomarkers for colorectal cancer. Gut http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2015-309800 (2015).[11] Zhang, X. et al. The oral and gut microbiomes are perturbed in rheumatoid arthritis and partly normalized after treatment. Nat. Med. 21, 895–905 (2015).
