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為什么read1和read2前幾個(gè)堿基的錯(cuò)誤率較高杈女？
測(cè)序儀先測(cè)完read1全長(zhǎng)岖沛，才跳轉(zhuǎn)測(cè)read2红选，測(cè)序儀自身在剛啟動(dòng)或關(guān)閉時(shí)不太穩(wěn)定，圖像識(shí)別質(zhì)量比較差，尤其是第一個(gè)堿基與最后一個(gè)堿基，測(cè)序質(zhì)量最差，緊挨著的幾個(gè)堿基測(cè)序質(zhì)量也偏高臣咖，一是測(cè)序儀從剛開始的不穩(wěn)定到穩(wěn)定，有一個(gè)過渡的過程漱牵。另外接頭空載夺蛇，也會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤率上升。(ILLUMILA工程師的說法)
這是因?yàn)殡S機(jī)引物擴(kuò)增的偏好性導(dǎo)致的酣胀。隨機(jī)引物擴(kuò)增偏好使得前邊一些堿基的堿基含量不平衡刁赦，因而在base-calling的時(shí)候算法不準(zhǔn)確，導(dǎo)致了錯(cuò)誤率高闻镶。 所謂的開機(jī)儀器不穩(wěn)定其實(shí)解釋不了read2開始?jí)A基錯(cuò)誤率也高的問題甚脉。 DNA文庫(kù)沒有這種隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)的過程，因而起始的幾個(gè)堿基的錯(cuò)誤率就沒有明顯高铆农。 也是同樣的道理牺氨，WGBS文庫(kù)因?yàn)閴A基含量的不平衡，而導(dǎo)致錯(cuò)誤率更高墩剖，在測(cè)序的時(shí)候就需要加入平衡文庫(kù)猴凹。
隨著測(cè)序的進(jìn)行，flowcell可能會(huì)受到熒光的損害之類的涛碑，因而測(cè)read2的時(shí)候flowcell已經(jīng)和read1的時(shí)候不同了精堕，因此read2的錯(cuò)誤率會(huì)更高一些。當(dāng)然熒光損害的說法也不太能找到根據(jù)蒲障，而測(cè)過read1之后，可能flowcell變得更臟了卻是很好理解的瘫证。
為什么隨著read延長(zhǎng)揉阎，測(cè)序錯(cuò)誤率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)？read2錯(cuò)誤率要普遍高于read1錯(cuò)誤率背捌？
測(cè)序過程中毙籽，每個(gè)cycle在熒光基團(tuán)淬滅，去3’端保護(hù)基團(tuán)時(shí)毡庆，沒有完全去除坑赡，導(dǎo)致在延伸過程滯留烙如，或者是加入了無3’端保護(hù)的堿基，導(dǎo)致延伸超前毅否，滯留和超前引起延伸步調(diào)不一致亚铁，這是一個(gè)累積的過程，越是往后螟加，超前或滯后的累積越多徘溢，測(cè)序錯(cuò)誤率也就越高。另外捆探，整個(gè)測(cè)序過程耗時(shí)較長(zhǎng)然爆，酶活性及試劑的有效性會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，測(cè)序過程先測(cè)read1黍图，后測(cè)read2曾雕，所以read2的錯(cuò)誤率要稍高于read1。另外助被，若待測(cè)片段中存在反向互補(bǔ)序列剖张，容易發(fā)生折疊，導(dǎo)致堿基在合成時(shí)錯(cuò)配（測(cè)序原理為邊合成邊測(cè)序）恰起。對(duì)于特異性序列GGC修械，若后面的堿基是G，GGC這種結(jié)構(gòu)引起聚合酶偏好性的改變检盼，會(huì)使錯(cuò)誤率增高肯污。
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