CoIP的原理圖

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文獻信息：

Abe, T., et al. (2017). "Germ-Cell-Specific Inflammasome Component NLRP14 Negatively Regulates Cytosolic Nucleic Acid Sensing to Promote Fertilization." Immunity 46(4): 621-634.

文獻截圖

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先看一下圖中的縮寫：

IP全稱是immunoprecipitation，即免疫沉淀，這一步主要是為了純化目的蛋白址否。

IB全稱是immunoblotting涵防，即免疫印跡渠驼，也就是常規(guī)的Western Blotting渤闷，用于顯示目的蛋白苗胀。

WCL全稱是whole cell lysates，即整個細胞的裂解成分绞惦。

HC全稱是heavy chain，即重鏈洋措，

LC全稱是light chain济蝉，即輕鏈。

結(jié)果查看

將圖分為三部分菠发，先看第一部分王滤，即上面的部分，“+”表示含有這種蛋白滓鸠，“-”表示沒有雁乡，這個實驗一共做了四組，從左到右分別為：①只表達HA-cGAS的293T細胞糜俗；②共同表達HA-cGAS與NRLP14-FL的293T細胞踱稍；③只表達STING-HA的293T細胞；④共同表達STING-HA與與NRLP14-FL的293T細胞悠抹，如下所示：

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再看第二部分WB的圖珠月，WB的圖就是使用含有FLAG抗體的珠子拉下來的蛋白做的，使用拉下來的這些蛋白再做WB锌钮，它的原理前面已經(jīng)描述過了桥温。使用FLAG抗體的珠子拉下來的蛋白使用HA抗體來進行檢測，其結(jié)果如下：

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從上面的圖像可以看出以下信息：

第一梁丘， HC與LC條帶都非常明顯侵浸，之所以出現(xiàn)這個條件是因為旺韭，在WB之前進行的蛋白變性這一步，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇掏觉，巰基乙醇會把抗體的重鏈和輕鏈之間的二硫鍵破壞区端，從而使的抗體變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD，因此會在結(jié)果中呈現(xiàn)兩個條帶澳腹。

第二织盼， 第一組（只表達HA-cGAS的293T細胞）中沒有條帶，第二組（共同表達HA-cGAS與NRLP14-FL的293T細胞）沒有條帶酱塔，第三組（只表達STING-HA的293T細胞）有一點點條帶沥邻，第四組（共同表達STING-HA與與NRLP14-FL的293T細胞）條帶明顯，這說明NLRP14與STING有相互作用羊娃，為什么說有相互作用呢唐全？因為我們是用FLAG抗體來拉的蛋白，從理論上講蕊玷，我們只能拉下FLAG標記的NLRP14邮利，也就是NLRP14-FL（FL就是FLAG），但是垃帅，從拉下的蛋白中用HA進行檢測延届，居然檢測出來了HA標記的STING，這就說明贸诚，使用FLAG拉NLRP14-FL時方庭，這個蛋白復合物中含有STING-HA。

再看圖的第三部分赦颇，也就是下面的這一部分二鳄，是用FLAG抗體和HA抗體來進行檢測整個細胞的裂解液，是作為陽性對照（有的文獻中會標明input組）媒怯，如下所示：

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其中右側(cè)的WCL表示的是整個細胞的裂解液订讼，也就是還沒有使用FLAG抗體的珠子去拉的時候的樣本，也就是說直接裂解了293T細胞后的樣本扇苞，從這個結(jié)果中可以得到以下信息：

第一欺殿， 在使用FLAG抗體進行檢測全蛋白時，相當于陽性對照鳖敷。第一組（只表達HA-cGAS的293T細胞）中沒有條帶脖苏，因為這種293T細胞中只有HA標記的cGAS，第二組（共同表達HA-cGAS與NLRP14-FL的293T細胞）有條帶定踱，因為FLAG抗體能檢測出使用了FLAG標記的NLRP14棍潘，NLRP14的蛋白分子量大概是125kD，第三組（只表達STING-HA的293T細胞）沒有條帶，因此這種293T細胞只表達HA標記的STING亦歉；第四組（共同表達STING-HA與與NLRP14-FL的293T細胞）條帶明顯恤浪，因為這個細胞中含有FLAG標記的NLRP14。

第二肴楷， 使用HA抗體檢測全蛋白水由，這是陽性對照，是說明細胞中含有相應的蛋白赛蔫。我們可以發(fā)現(xiàn)砂客，第一組（只表達HA-cGAS的293T細胞）在27kD附近沒有條件，在50kD部分有條帶呵恢，這說明鞠值，全蛋白中含有HA標記的cGAS（cGAS的蛋白分子量是62kD，多數(shù)蛋白標簽的分子量很少渗钉，基本可以忽略）齿诉，做這個實驗主要是作為陽性對照；第二組（共同表達HA-cGAS與NLRP14-FL的293T細胞）在37kD附近沒有條帶晌姚，在50kD附近有條帶；結(jié)合前面的結(jié)果來看歇竟，就說明這個細胞中含有HA標記的cGAS（因為它的分子量大概是50kD）挥唠，還含有FALG標記的NLRP14（因為NLRP14的蛋白分子量大概是125kD）；第三組（只表達STING-HA的293T細胞）在37kD處有條帶焕议，這說明細胞中含有HA標記的STING（因為STING的分子量大概是35kD）宝磨；第四組（共同表達STING-HA與與NLRP14-FL的293T細胞）在110kD處有條帶，在37kD處也有條帶盅安，這說明這種細胞中含有NLRP14與STING唤锉。

從上面的圖片可以知道，在做Co-IP實驗時别瞭。需要設立陽性對照組來證明你的細胞中有某個蛋白A與B窿祥，再使用抗蛋白A的抗體來拉A蛋白，再使用抗蛋白B的抗體來檢測拉下來的蛋白蝙寨，如果檢測到了蛋白B晒衩，就說明蛋白A與蛋白B有相互作用。