今天精讀的文獻是2月13日發(fā)表在《Nature Plants》上的《Integration of ovular signals and exocytosis of a Ca2+ channel by MLOs in pollen tube guidance》
早期接觸MLO這個家族還是讀遺傳發(fā)育所高彩霞老師發(fā)表在《Naure Biotechnology》上論文，她們用Crispr技術敲掉了小麥中的MLO（小麥是六倍體矩距，基因有三個拷貝丈探，難度大），發(fā)現(xiàn)高抗白粉病颜骤，那時候我還在讀大三样悟，再次接觸這個家族是今年寒假初期馒闷，羅靜初老師讓我找一找植物中是否存在GPCR拂到，當時了解到MLO本身是一個七次跨膜蛋白遏匆，但是沒有G蛋白偶聯(lián)，所以可能并不是一個標準的GPCR谁榜，也看到擬南芥中這個家族在生殖過程中有表達幅聘，所以也猜測可能會有作用，沒想到?jīng)]過兩周文章就發(fā)出來了窃植。真的是世事無常暗圯铩！閑話不多說巷怜，先讀文章為敬葛超！
本篇文章的通訊作者是遺傳發(fā)育發(fā)育所的楊維才老師，他的研究工作主要聚集在植物生殖發(fā)育的分子遺傳學延塑，尤其是 雌配子體和胚胎發(fā)育過程中細胞極性绣张、細胞命運、細胞分化和雌雄配子細胞相互作用的分子遺傳機制关带。其目標是利用擬南芥侥涵、水稻等模式植物來探討發(fā)育生物學的基本問題，并以此為模式研究農(nóng)作物基因功能宋雏。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)花粉管在極性生長時芜飘，存在大量細胞質Ca2+的動態(tài)變化參與，但是來自胚珠信號是如何參與這一過程目前還不清楚磨总，本次揭示 MLO5 MLO9和MLO15這三個基因在此過程中起作用嗦明。
在植物生長發(fā)育，遇光蚪燕，接觸以及外界脅迫等其他情況時娶牌，細胞質中Ca2+一般能夠作為第二信使傳遞信號奔浅，這種Ca2+信號傳遞依賴于鈣離子滲透通道（進入細胞質中），Ca2+-ATPase（Ca泵裙戏，泵出細胞）以及Ca2+/H+ exchangers（Ca2+/H+反向轉運蛋白乘凸，存進液泡），其中Ca2+離子通道包括有?CNGCs(cyclic nucleotide-gated channels), GLRs(glutamate receptors), annexins, two-pore channel 1 hmechanosensitive channels累榜。而MLO作為跨膜蛋白很有可能在信號傳遞過程中發(fā)揮作用营勤，MLO在擬南芥中共有15個成員，MLO1, MLO5和MLO9表達在花粉和花粉管中壹罚，而且MLO5的表達受到花粉管穿過柱頭的誘導葛作。所以作者猜測這幾個基因能夠在生殖過程中起作用。
所以作者的科學問題是依據(jù)基因的表達量和特異性推測的MLO成員是否在生殖中其作用呢猖凛？
所以作者首先利用qRT–PCR的辦法驗證這個基因的表達到底高不高赂蠢？（算是核驗一下RNA-seq的結果）可以看到在花粉當中MLO1/5/9/15表達量相對較高，且MLO5和MLO9的特異性很強辨泳，僅僅在花粉中表達虱岂，不在根中表達，且演化樹聚在一支上菠红，可能存在功能冗余第岖，此外MLO1和MLO15在花粉和根中都表達，且演化樹都聚在一支上试溯。任何一個單突沒有表型蔑滓，mlo5-1mlo9?(T-DNA)雙突在種子產(chǎn)量以及花粉萌發(fā)的過程中都沒有任何問題，但是在mlo5-1 mlo9+/–?后代分離比出現(xiàn)了與1:2:1的偏離遇绞，并且mlo5-1mlo9 雄配子體傳遞率嚴重下降（44.5%）键袱，但是雌配子體傳遞率不受影響，說明主要是雄方的問題摹闽。這就不禁引起作者的好奇蹄咖。利用苯胺藍染色（將細胞組織中的膠原蛋白染色為水藍色）觀察花粉管穿過柱頭，mlo5mlo9? 雙突的花粉管當接近珠柄時在隔膜附近纏繞起來付鹿，但是有的花粉管在纏繞之后又能爬上珠柄完成受精比藻，但是無疑會降低對胚珠的競爭力。mlo5-1 mlo9?花粉管出現(xiàn)纏繞的概率大約是64%倘屹。作者猜測種子產(chǎn)量沒有下降的原因是花粉足夠银亲，于是采用限量授粉，發(fā)現(xiàn)雙突的材料的導向胚珠的能力的確是大大下降,并且這一表型能夠被MLO5-GFP 和 MLO9-GFP互補纽匙。觀察MLO5 MLO9 的定位發(fā)現(xiàn)都定位在質膜和花粉管的膜內(nèi)囊泡中务蝠。由于MLO預測含有一個CaM-binding的結構域，作者認為這個結構域對蛋白的定位非常重要烛缔，于是將MLO5該結構域的關鍵位點進行W443R的突變馏段，膜定位消失并且互補功能也喪失轩拨。此外，mlo5 mlo9?雙突花粉管在授粉3h或5h生長速度較慢院喜，但是在8h后看不到差異亡蓉。于是他們認為MLO5/9在響應雌方的信號物質存在缺陷。
為了進一步探究MLO5和MLO9的功能喷舀，作者進行了半體外授粉實驗進行詳細觀察砍濒。在這個實驗當中，作者觀察到僅有12%左右的花粉管出現(xiàn)纏繞或者展開硫麻，遠遠低于體內(nèi)的比例爸邢。作者猜測這是由于半體外受精打破了隔膜和珠柄的聯(lián)系，例如培養(yǎng)基上分泌不出足夠的信號或是在體外隔膜和珠柄之間的90°角并不存在拿愧。當胚珠靠的足夠近時杠河，異常并不存在。如果使用AtLURE1.2作為吸引物質浇辜，發(fā)現(xiàn)雙突和WT出現(xiàn)打轉比例差不多券敌，暗示打轉的表型可能是由于其他未知的信號決定的。如果將 mlo5/9 的花粉受給胚珠缺陷的spl 或是 ino 突變體柳洋，可以看到打轉的比例大大下降讥邻，有趣的是如果受給近緣物種 lyrata庭惜，打轉的比例也是大大下降敞峭，暗示著吸引物質是一個雌方分泌的物種特異的信號赃磨。
MLO5自身啟動子驅動蛋白表達能夠互補 mlo5 mlo9 雙突的表型立由。mlo5mlo9 的花粉管對低外源Ca2 +濃度敏感轧钓，對Ca2+通道阻滯劑La3 +不敏感，于是作者推測MLO5/9可能在作用于鈣內(nèi)流的過程中發(fā)揮功能锐膜，利用G-CaMP5的成像Ca2+毕箍，可以看出Ca2+在細胞質內(nèi)的濃度大大下降，僅僅在花粉管頂端有表達道盏。那到底MLO5/9如何影響Ca2+的呢而柑？在先前的研究過程GNCG18以及GLR1.2被報道參與了花粉管的生長和導向過程，如果在 mlo5/9 突變體背景下觀察GNGC18和GLR1.2的定位荷逞，可以發(fā)現(xiàn)CNGC18的蛋白定位大大減弱,但是GLR1.2不受影響媒咳。此外一些其他生殖相關的膜蛋白PIP2;7-GFP, MDIS1-GFP, PRK6-GFP,ANX1-GFP, Lti6b-GFP 和 RABA4d-GFP在 mlo5/9當中均不受影響。如果使用兩個 cngc18 的點突突變體种远，苯胺藍染色發(fā)現(xiàn)打轉或是分支的表型沒有出現(xiàn)涩澡，并且cngc18 對 Atlure1.2處理不敏感。進一步研究發(fā)現(xiàn)無論是在?mlo5/9 又或是?WT 背景下CNGC18 的轉錄水平無明顯變化坠敷，但是如果在雙突背景下過表達能夠回補半體外的打轉表型妙同。因此CNGC18可能部分參與到 mlo5/9 介導通路當中射富。
那會不會還有其他的MLO基因與MLO5/9存在功能冗余呢？于是他們在 mlo5/9 的基礎上進一步敲除了 MLO15粥帚，發(fā)現(xiàn)這種花粉管打轉轉的表型進一步提升胰耗，并且出現(xiàn)敗育的表型，敗育的位置在角果中隨機出現(xiàn)芒涡，暗示花粉管的生長沒有問題柴灯。為了進一步探究MLO家族的冗余性，他們利用 MLO1-GFP, MLO15-GFP 和 MLO2-GFP進行回補拖陆，發(fā)現(xiàn)僅僅有MLO1 和 MLO15 能夠回補?mlo5/9?的表型弛槐。因此MLO1/15可能與MLO5/9的功能相近。
為了進一步闡述MLOs和CNGC18的關系依啰，他們在含有AtLURE1.2的培養(yǎng)基中觀察了Ca2+的變化乎串，在WT中花粉管轉向發(fā)生改變時，會檢測到鈣的不對稱分布速警，但是在 mlo5/9 中不對稱分布消失叹誉。有趣的是，MLO9-GFP也會在花粉管轉向的過程中發(fā)生定位極性分布闷旧，暗示著MLO9和CNGC18參與介導了導向性生長期間Ca2+的內(nèi)流长豁。
那么MLO是否能夠直接招募CNGC18呢？通過酵母雙雜忙灼，他們確定了MLO9與MLO5和CNGC18的相互作用匠襟，通過截短實驗，發(fā)現(xiàn)MLO5的C端與CNGC18的LCI的相互作用该园。詳細觀察MLO5和CNGC18的囊泡定位酸舍，發(fā)現(xiàn)兩者并不overlap，如果用ConcA里初，一個誘導順式高爾基體和內(nèi)體聚集以及分泌的阻礙物啃勉，發(fā)現(xiàn)兩者囊泡定位在完全不同的結構中。
通過大規(guī)模的酵母雙雜實驗双妨，鑒定到MLO5與 VAMP721 和 VAMP722存在相互作用淮阐，這兩個蛋白屬于SNARE蛋白，調控胞吐過程中囊泡與細胞膜的融合刁品。MLOC 與CNGC18C 和 VAMP721longin均存在互作泣特。vamp721 和 vamp722?單突均沒有表型，雙純種系致死挑随，一純一雜的突變體同樣也會出現(xiàn)打轉轉的表型群扶。并且CNGC18-GFP在vamp721?vamp722?出現(xiàn)兩種不同定位，暗示著VAMP721/722調控了CNGC18的運輸過程。
讀完這篇文章竞阐，我總感覺有些繞來繞去缴饭。不否認這篇文章做了大量的工作,但是很多結果值得商榷，MLOs與花粉管導向的關系以及MLOs與Ca2+之間關系骆莹，仍然可以繼續(xù)探討颗搂。
