任何測量都要考慮精度和通量的問題包颁，生物測量亦如此瞻想。當(dāng)測序成本受到限制時(shí)，通常需要在較大的細(xì)胞數(shù) & 較小數(shù)據(jù)量和較小的細(xì)胞數(shù) & 較大數(shù)據(jù)量之間進(jìn)行權(quán)衡娩嚼，那對于單細(xì)胞測序來講蘑险，細(xì)胞數(shù)和測序數(shù)據(jù)量對于分析結(jié)果有何影響呢？
2016 年 Heimberg et al 開發(fā)了一個(gè)公式岳悟，評估測序數(shù)據(jù)量對測序樣本區(qū)分能力的影響（測序數(shù)據(jù)量對主成分再現(xiàn)度的影響）佃迄。研究人員選擇了 19 個(gè)不同小鼠轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（平均測序數(shù)據(jù)量 107 reads）泼差，分析發(fā)現(xiàn) 1% 的測序數(shù)據(jù)即可有效區(qū)分樣本（圖 1）。具體而言呵俏，當(dāng)測序數(shù)據(jù)量達(dá)到 55,000 reads/ 樣本時(shí)堆缘，前三個(gè)主成分（PC1、PC2柴信、PC3）再現(xiàn)度超過 80％套啤，而若使前九個(gè)主成分均達(dá)到 80％的準(zhǔn)確度，則需要 145,000 reads随常，進(jìn)一步增加測序深度對主成分精度的貢獻(xiàn)會遞減潜沦。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的核心分析內(nèi)容構(gòu)建細(xì)胞圖譜，區(qū)分不同細(xì)胞類型绪氛，類似于 Bulk RNA-seq 中的樣本 PCA 分析唆鸡。為了分析測序數(shù)據(jù)對細(xì)胞類型區(qū)分的影響，Heimberg 選擇了 Zeisel et al 于 2015 年發(fā)表在 Science 的文章的數(shù)據(jù)（3005 個(gè)大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)細(xì)胞枣察，15000 unique trans/cell）進(jìn)行了分析争占。使用相同的公式，發(fā)現(xiàn)測序數(shù)據(jù)在1000 trans/cell 情況下序目，前三個(gè)主成分的再現(xiàn)錯誤率分別是 11%臂痕、22% 和 38%（圖2A）。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)猿涨，當(dāng)數(shù)據(jù)量只有 100 trans/cell 時(shí)握童，即可有效區(qū)分少突膠質(zhì)細(xì)胞和兩類錐體神經(jīng)元，準(zhǔn)確度 >90％叛赚。而當(dāng)數(shù)據(jù)量達(dá)到 1000 trans/cell 時(shí)澡绩，不僅可以區(qū)分少突膠質(zhì)細(xì)胞和兩類錐體神經(jīng)元，還能夠?qū)深愖刁w神經(jīng)元（海馬錐體神經(jīng)元和皮層錐體神經(jīng)元）區(qū)分開俺附，準(zhǔn)確度 >90％（圖 2B）肥卡。
Heimberg et al 的結(jié)果表明，低測序深度情況下可以實(shí)現(xiàn)樣本分群 / 細(xì)胞聚類事镣。而為了進(jìn)一步分析測序數(shù)據(jù)量和細(xì)胞數(shù)對細(xì)胞聚類的影響步鉴，10X 官方設(shè)置了不同測序數(shù)據(jù)量和細(xì)胞數(shù)對 PBMC 主要細(xì)胞類型檢測的實(shí)驗(yàn)：
1、對 4000 個(gè) PBMC 細(xì)胞測序蛮浑，平均測序數(shù)據(jù)量為 50K reads/cell唠叛；
2、隨機(jī)抽樣設(shè)置不同測序深度：500沮稚、1K艺沼、2.5K、 5K蕴掏、 7.5K障般、10K调鲸、 15K,、25K和 50K reads/cell挽荡；
3藐石、隨機(jī)抽樣設(shè)置不同細(xì)胞數(shù)：100、200定拟、400于微、600、800青自、1K株依、2K、 3K 和 4K細(xì)胞
測序深度的影響
此次評估過程采用的是 10X Genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 V2 試劑延窜，V2 試劑建議的最低測序數(shù)據(jù)量是 50K reads/cell恋腕，通過圖 3 可知，當(dāng)平均測序數(shù)據(jù)達(dá)到 50K reads/cell 時(shí)逆瑞，測序飽和度荠藤、檢測到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量 / 細(xì)胞、基因數(shù)量 / 細(xì)胞以及總基因數(shù)基本飽和获高，表明官方推薦數(shù)據(jù)量足夠數(shù)據(jù)分析哈肖。
對于檢測細(xì)胞數(shù)，低測序數(shù)據(jù)量（平均 506 reads/cell）和高測序數(shù)據(jù)量（平均86503 reads/cell）相差不大念秧，檢測到細(xì)胞數(shù)分別是 4273牡彻、4353，但是兩種測序深度下出爹，檢測到的基因中位數(shù)差別很大，分別是 160缎除、1234（圖 4）严就。
盡管低測序深度時(shí)部分指標(biāo)靈敏度較低，但是通過 graph-based 聚類依然推定了不同細(xì)胞亞群器罐，t-SNE 聚類圖見圖 5A梢为。基于 CD3D轰坊、CD3E 鑒定 T 細(xì)胞 ; GNLY铸董、NKG7 鑒定NK 細(xì)胞 ; CD79A、CD79B 鑒定 B 細(xì)胞肴沫；CD14粟害、FCGR3A 鑒定單核細(xì)胞（圖 5B）。
在細(xì)胞聚類和鑒定基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析颤芬，不同測序深度范圍內(nèi)悲幅，四種細(xì)胞類型（T 細(xì)胞套鹅、NK 細(xì)胞、B 細(xì)胞汰具、單核細(xì)胞）分類準(zhǔn)確度范圍為 93-99%（圖 6A卓鹿、B），當(dāng)測序深度達(dá)到 2.5K reads/cell 時(shí)留荔，細(xì)胞類型分類準(zhǔn)確度達(dá)到 98% 并且相對一致吟孙。當(dāng)測序深度降低到500 reads/cell 時(shí)，相比飽和測序數(shù)據(jù)量聚蝶，細(xì)胞類型分類準(zhǔn)確度降低幅度（7%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于轉(zhuǎn)錄本中位數(shù) /cell（94%）杰妓、基因中位數(shù) /cell（87%）和總基因鑒定數(shù)（33%）的降低幅度。
另 外既荚，2019 年 發(fā) 表 在 Circulation 上 的 文 章“Single-Cell Analysis of the Normal Mouse Aorta Reveals Functionally Distinct Endothelial Cell Populations”在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室 比較了不同測序深度對細(xì)胞聚類的影響稚失，4 個(gè)主動脈樣本中，2 條主動脈樣本測序深度低 (17,000 reads/cell)恰聘，2 條主動脈樣本測序深度高 (145,000 reads/cell)句各，分析得到的細(xì)胞數(shù)量二者之間無差異。
以上數(shù)據(jù)說明晴叨，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在官方推薦的數(shù)據(jù)量下（V2 試劑凿宾，官方推薦數(shù)據(jù)量 50K reads/cell；V3 試劑兼蕊，官方推薦數(shù)據(jù)量 20K reads/cell）初厚，分析獲得的各項(xiàng)指標(biāo)：細(xì)胞檢測數(shù)、測序飽和度孙技、轉(zhuǎn)錄本产禾、基因檢測飽和度以及檢測基因總數(shù)均可以達(dá)到飽和，當(dāng)然考慮到單細(xì)胞懸液制備時(shí)可能會存在細(xì)胞碎片等背景干擾牵啦，占用一部分?jǐn)?shù)據(jù)亚情，可以在選擇測序數(shù)據(jù)量時(shí)，對測序數(shù)據(jù)量進(jìn)行加倍（例如 5000 個(gè)細(xì)胞官方推薦最低測序數(shù)據(jù)量為30G哈雏，實(shí)際測序可以測60G）楞件，但是也不需要加測太多數(shù)據(jù)，因?yàn)榧訙y太多數(shù)據(jù)得到的收益（例如提高測序飽和度等）增幅遠(yuǎn)低于付出的測序成本裳瘪。
細(xì)胞數(shù)量的影響
為了評估捕獲得到的細(xì)胞數(shù)對細(xì)胞類型分類準(zhǔn)確性的影響土浸，在每個(gè)讀取深度基礎(chǔ)上按照 100-4000 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行二次取樣。在測序深度為 50K reads/cell 時(shí)彭羹，不同細(xì)胞數(shù)量下細(xì)胞類型分類準(zhǔn)確性范圍為 82-99％（圖 6C）黄伊。當(dāng)細(xì)胞數(shù)是 1000 時(shí)，精確度變化幅度為10％（87-98％）派殷，而在 100 個(gè)細(xì)胞時(shí)毅舆，準(zhǔn)確度估計(jì)值為 55-92％西篓，表明隨著細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少，細(xì)胞分類準(zhǔn)確度變異性增加憋活。綜合測序數(shù)據(jù)量和細(xì)胞數(shù)岂津，可知在低細(xì)胞數(shù)情況下，隨著測序深度增加悦即，細(xì)胞類型分類準(zhǔn)確度依然維持在較低水平吮成，但在低測序深度情況下，細(xì)胞類型分類準(zhǔn)確度可以隨細(xì)胞數(shù)量增加而增加辜梳，表明細(xì)胞數(shù)對細(xì)胞類型分類準(zhǔn)確度的影響大于測序深度粱甫。
參考文獻(xiàn)
Heimberg, G., Bhatnagar, R., El-Samad, H., & Thomson, M. (2016). Low Dimensionality in Gene Expression Data Enables the Accurate Extraction of Tranional Programs from Shallow Sequencing. Cell Systems, 2(4), 239–250. doi:10.1016/j.cels.2016.04.001.
Kalluri, A. S., Vellarikkal, S. K., Edelman, E. R., Nguyen, L., Subramanian, A., Ellinor, P. T., … Gupta, R. M. (2019). Single Cell Analysis of the Normal Mouse Aorta Reveals Functionally Distinct Endothelial Cell Populations. Circulation.doi:10.1161/circulationaha.118.038362.
