構建tPD-L1 KO的腫瘤細胞系[CRISPR/Cas9]：
1.病毒構建
2.腫瘤細胞與病毒顆粒在12孔板中共培養(yǎng)（5x10^5 細胞/孔），直到細胞達到30-50%的confluence：? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.1 加入稀釋液[2.5ml 50% OPTI-MEM+50% DMEM]烁涌，37℃過夜? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.2 將基質(zhì)液吸引掉帐姻，加入混合液[0.5ml 病毒溶液+0.5ml RPMI+0.6ul 凝聚胺polybrene]，混合悯恍，37℃库糠，48-60h? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.3 收集細胞到10-cm dish中，培養(yǎng)涮毫。加入嘌呤霉素puromycin(5ug/ml) 3天[篩選轉(zhuǎn)染成功的細胞]
3.30ng/ml mIFNγ刺激過夜[IFNγ刺激PD-L1表達]
4.BD流式分選
a defined in vitro CTL-tumorinteraction system：
2/20 CTL——4T1 or CT26
2/20 CTL細胞系不需要從naive狀態(tài)分化
2種肺轉(zhuǎn)移模型：
1.4T1自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型
2.實驗肺轉(zhuǎn)移模型
methylcholanthrene瞬欧，MCA 甲基膽蒽誘導腫瘤形成：
小鼠皮下注射100ug甲基膽蒽
3個月后可取腫瘤
BMDM(Bone marrow-derived macrophage) generation and treatment:
1.取小鼠股骨、脛骨罢防，置于70%乙醇中消毒10min艘虎，后用PBS沖洗
2.用RPMI(1640)沖洗骨髓腔
3.將骨髓細胞混合液制成單細胞懸液：過100uM濾網(wǎng)，裂紅
4.將5×10^6骨髓細胞置于10cm細胞培養(yǎng)皿(culture dish)中咒吐，皿中為完全培養(yǎng)基+50ng/ml mM-CSF野建。培養(yǎng)第三天更換新的培養(yǎng)基
5.第6-7天，收集巨噬細胞至PBD+1mM EDTA中
6.流式檢測純度[CD45+CD11b+F4/80+]
髓系細胞清除實驗：
有研究證明：氯磷酸鹽脂質(zhì)體能夠通過清除巨噬細胞恬叹、髓系細胞促進肺轉(zhuǎn)移
