Tissue-specific abundance of interferon-gamma drives regulatory T cells to restrain DC1-mediated priming of cytotoxic T cells against lung cancer

嘗試做個小精讀

• CTL：cytotoxic T lymphocytes 細胞毒性T淋巴細胞
• KP小鼠：Kras G12D / Trp53雙敲肺癌細胞系接種小鼠
• SIINFEKL：作為多聚體刺激抗原特異性T細胞（比如強烈激活CTL的免疫應答）
• OT-1小鼠：是體內CD8+T特異性識別OVA
• Batf3 -/-小鼠：Batf3 -/-好像會導致免疫缺陷滨达？
• tdLN：腫瘤引流淋巴結
• TIM3免疫檢查點：T細胞激活的標志速和。

縱膈淋巴結mLN VS 腹股溝淋巴結iLN

原始CD8+ T細胞被DC1激活 ==> 變成CTL細胞

T細胞默認淋巴結產(chǎn)生

DC1s in mLNs prime dysfunctional CD8+ T cells against lung KP tumors

縱膈淋巴結中的DC1可以啟動功能失調的CD8+T細胞在KP小鼠中發(fā)揮抗腫瘤作用

目的：CTL的啟動在肺癌中如何被抑制？

分別在小鼠肺原位及側腹接種KP肺癌細胞系玄窝，并且工程表達帶ZsGreen的模型抗原SIINFEKL（熒光素酶報告基因？），養(yǎng)七天后檢測相應tdLN中的CD8+ T活化情況亡问。雖然在兩種腫瘤中都表達了SIIN激活的T細胞，但是mLN中CD25及顆粒酶B表達量降低躺率。iLN中T細胞免疫球蛋白（T cell immunoglobulin）及黏蛋白結構域蛋白3（mucin domain-containing protein 3玛界，TIM3）增加万矾。

• 這兒CD25是IL-12的Marker
• 顆粒酶B（Granzyme B,GZB）主要通過激活Caspase-3來激活細胞凋亡悼吱，是有力的細胞免疫殺傷因子，能真正反映機體免疫激活狀態(tài)

圖片.png

接著良狈，通過體內啟動實驗（in vivo priming assay）后添，作者接著證明了表型及功能差異與T細胞受體信號（TCR）強度無關。在mLN中薪丁，OT-1 T細胞出現(xiàn)了強勁的增殖遇西，但是CD25馅精、GzmB和TIM3的表達降低。但是這種T細胞的增殖不是SINNFEKL特異的粱檀。

圖片.png

既往研究報道過交叉呈遞DC1可以增強抗腫瘤免疫應答洲敢。 接

在Batf3 -/-小鼠中（DC1沒有了）打肺和側腹腫瘤，發(fā)現(xiàn)SIINFKEL反應性的T細胞激活嚴重受損茄蚯。
在XCR1 DTR小鼠模型及KP-SIY腫瘤細胞中压彭，進一步驗證了DC1在mLN中啟動腫瘤反應性T細胞的需求（？）渗常。

圖片.png

這兒作者還比較了一下DC2激活CD8+ T細胞的能力壮不，最后證明是ZsG+的DC亞群能激活腫瘤T細胞，但是DC1可以促進增殖和聚集皱碘。（附圖偷懶）

縱膈tdLN中的DC1s具有高信號1询一，低信號2和3

DC存在不同功能狀態(tài)，這些狀態(tài)取決于信號1癌椿、2健蕊、3：

• 信號1：抗原（MHC？）
• 信號2：共刺激因子踢俄，CD80和CD86
• 信號3：細胞因子绊诲，IL-12

我理解就是三種因素共同反應DC細胞的狀態(tài)

前文說DC1在縱膈和腹股溝淋巴結中表型不同（是不是CD25，GzmB）等等的表達不一樣褪贵？

得到假設：DC1的組織特異性導致了不同的啟動結果掂之。 鑒定了ZsG+ DC1的三種信號。

解讀一下這個圖：就是橫軸縱軸應該是不同的成分加染料脆丁。

• CD11b / CD11c
  • CD11b: 單核細胞世舰，巨噬細胞，中性粒細胞槽卫，NK細胞等
  • CD11c：樹突細胞跟压，單核細胞，巨噬細胞歼培，中性粒細胞震蒋。（第四列篩出DC細胞）
• Ly6C：小鼠常用的單核細胞標記物？（和CD11b共同篩選單核細胞）
• CD45：在所有白細胞上都有表達躲庄，稱為白細胞共同抗原（leukocyte common antigen查剖，LCA)。CD45是細胞膜上信號傳導的關鍵分子噪窘，在淋巴細胞的發(fā)育成熟笋庄，功能調節(jié)及信號傳遞中具有重要意義，CD45的分布可作為某些T細胞亞群的分類標志。
• MHC-II：那個什么組織復核嗚啥啥的直砂，就圖里字面意思菌仁，篩出MHC II陽性的
• F4/80：F4/80是一種孤兒受體，參與細胞黏附静暂，并可能參與專門涉及免疫系統(tǒng)細胞的細胞間相互作用济丘。 它也可能在調節(jié)性T細胞（Treg）的發(fā)育中發(fā)揮作用。成熟小鼠巨噬細胞標志物洽蛀。（所以第四列圖篩出了非巨噬細胞的那一類闪盔，Mac = Macrophage？）
• CD103：小鼠cDC1細胞可以由組織樣本以及CD8或CD103所決定辱士，小鼠cDC2細胞可以由常見的cDC標志物和CD11b的表達來鑒別

圖片.png

留一張標記表

圖片.png

然后在流式上這些變化不顯著泪掀，所以做了柱狀圖（？）颂碘。mLN中ZsG+ DC1的豐度增加异赫，但兩種tdLN的ZsG強度相似，表明DC1吞噬腫瘤碎片并遷移到縱膈tdLN的能力沒有缺陷头岔。（另外體外實驗證明了兩種tdLN中ZsG+ DC1激活原始CD8+ T的能力差不多塔拳，附圖）

理解：ZsG強度相似說明到tdLN的腫瘤碎片差不多？

圖片.png

接著應該主要是測了一下Marker峡竣？

mLN中ZsG+ DC1s的CD80和CD86表達降低靠抑，CD40表達不變。

• CD40：共刺激 B 細胞生長适掰，參與分化和同型轉換颂碧。
• CD80 / CD86：共刺激 T 細胞激活和增殖。

圖片.png

mLN的ZsG+ DC1s產(chǎn)生更少的IL-12(圖E)类浪。

由于信號2 (CD80和CD86)和信號3 (IL-12)的低表達是未成熟dc的特征（說明iLN成熟度不高）载城，我們檢測了成熟標記物MHC-II和CCR7。兩種分子都在mLN的ZsG+ DC1s上高度表達（圖F）费就。

圖片.png

前文結論
mLN中腫瘤來源的DC1高度成熟诉瓦，并提供足夠的信號1，但CD80力细、CD86和IL-12的表達減少睬澡，這是啟動真正CTL所必需的。

• 一個背景：成熟的dc可以獲得免疫調節(jié)分子(mregDC)眠蚂，并在吞噬腫瘤碎片后抑制抗腫瘤免疫
  知道m(xù)LN里是成熟的DC1之后煞聪，研究者檢測了mregDC標記物（CD40, IL-12和PD-L1），結果顯示CD40的表達相似（圖D）河狐，而IL-12和PD-L1在mLN的ZsG+ DC1上減少（圖E, 附圖偷懶)米绕。此外瑟捣，在ZsG- DC1上也檢測到mLN特異性的CD80馋艺、CD86和IL-12表達下降（和圖D栅干、E一樣）

不懂：這表明組織特異性的抑制不同于mregDC程序。
嘗試理解：mregDC的標記物證明上調證明可以吞噬腫瘤碎片并抑制抗腫瘤免疫捐祠，但是這幾個玩意在DCc1里減少碱鳞，證明這種抑制不是mregDC那種的

腫瘤引流mLN中DC1s上CD80、CD86和IL-12的表達減少可能表明DC1固有的組織特異性抑制踱蛀。然而窿给，在幼稚小鼠中，DC1s信號2（CD80）和3（IL-12）的組織特異性差異不再被檢測到（附圖偷懶）

嘗試理解：小老鼠的mLN里率拒，組織特異性檢測不到崩泡，所以組織特異性并不是DC1s的固有屬性。

此外猬膨，與mLN特異性誘導體內功能障礙CD8+ T細胞相比（前一節(jié)DE）角撞，來自兩個LNs的ZsG+ DC1s在離體誘導CD25和GzmB高表達的CTL（附圖偷懶）。因此勃痴，mLN中CD8+ T細胞的功能失調反應并不是由DC1內在缺陷引起的谒所，而是由DC外部的、mLN特異性的沛申、腫瘤依賴的因子在體內抑制了CTL激活劣领。

嘗試理解：體內引起障礙，體外就高表達CTL铁材，那說明體內的障礙不是DC1本身導致的尖淘，而是一種和腫瘤相關的，mLN里面比較特異的機制著觉，誘導了TL激活（德澈？）

Treg cells can induce CD8+ T cell dysfunction and DC1 suppression

Treg細胞可誘導CD8+ T細胞功能障礙和DC1抑制

• Treg可以通過消耗CD80、CD86來抑制DC細胞的激活能力固惯。（Treg耗竭了CD80梆造、CD86之后就沒因子激活CTL？）
• 前文說了mLN中葬毫，ZsG+ DC1的CD80和CD86都低表達镇辉。
• 提出假設：會不會是Treg耗竭這些因子？導致CD8+ T細胞的功能失調贴捡。

這兒使用FoxP3 DTR小鼠忽肛，來評估Treg對SIIN激活的CD8+ T細胞的影響。

• FoxP3對小鼠和人類的T調節(jié)(Treg)細胞譜系規(guī)范和功能很重要烂斋。Foxp3-DTR小鼠從Foxp3基因座表達敲入的人類DTR和EGFP屹逛，而不會破壞內源性Foxp3基因表達础废。在給予DT后，將這些小鼠用于耗盡Treg細胞罕模。（給DT后耗竭Treg）

在耗竭Treg之后评腺，tdLN里面的CD25和GzmB都顯著增加，且在mLN中耗竭Treg后CD8+ T細胞拯救作用更大淑掌，證明Treg在mLN中的抑制功能更強蒿讥。

圖片.png

小結論：Treg在mLN中的腫瘤特異性T細胞應答的重塑中具有重要作用。

為了進一步證明短暫Treg的影響抛腕，在小鼠中短暫耗盡Treg（只用DT處理兩天芋绸？），同樣激活了mLN中的CTL啟動担敌。

圖片.png

瞬時Treg耗竭也導致了ZsG+ DC1的CD80和CD86增加摔敛，但是IL-12沒有增加。

圖片.png

iLN也類似（附圖偷懶）

小結論：Treg細胞抑制腫瘤反應性T細胞反應和DC1刺激能力全封，對CTL的抑制在mLN
中更有效马昙。

Treg cells from the tumor-draining mLN restrain cytotoxic T cell priming by suppressing DC-derived signals 2 and 3

來自腫瘤引流mLN的Treg細胞通過抑制DC衍生信號2和3抑制細胞毒性T細胞啟動。

• 背景：
• 第一節(jié)中說：mLN中的CD8+ T細胞啟動需要DC1s
• 第三節(jié)中說：而Treg細胞抑制CTL分化
• 假設mLN中的Treg細胞通過抑制DC1s來抑制CD8+ T細胞啟動售貌。

插個題外話
第一節(jié)說给猾，DC1在肺里是記過功能失調的CD8+，但是不知道是不是激活CTL（應該不是）
第三節(jié)又說成熟的DC1颂跨，但是CTL激活相關的因子低表達敢伸，抑制了CTL的激活。

應用還原性體外共培養(yǎng)實驗共培養(yǎng)幼稚OT-I T細胞與mLN分離的ZsG+ DC1s和Treg細胞恒削。在低Treg:OT-I T細胞比例時池颈，Treg細胞導致OT-I T細胞上CD25和GzmB表達顯著降低，而CD8+ T細胞增殖僅輕度降低钓丰。

理解一下：這個圖里應該就是全是low ratio的躯砰，然后B是加ZsG+ DC1，C是加共刺激因子（抗CD3/28）然后出來的CD8+ T細胞沒少多少携丁，但是CD25和GzmB降低說明功能受損

圖片.png

這種CD25低琢歇，GzmB低的表型不就是第一節(jié)中的那種功能障礙的CD8+ T細胞嗎？

為了測試Treg細胞是否需要DC1s來誘導功能失調的CD8+ T細胞梦鉴，我們使用抗(a)CD3和aCD28來刺激OT-I T細胞（一個加DC1李茫，一個CD3/28來刺激）。結果是在沒有DC1s的情況下肥橙，相同數(shù)量的Treg細胞對OT-I T細胞上CD25和GzmB表達的影響就變小了魄宏。

小結論：

• 前文說DC1介導了功能失調的CD8+ T細胞
• Treg細胞可以通過耗竭CD80/86將DC1介導的CTL啟動重定向為功能失調的類群，但這種抑制需要DC1s的存在存筏。

附圖偷懶環(huán)節(jié)
為了確定體外共培養(yǎng)的CD8+ T細胞狀態(tài)和第一節(jié)中的體內啟動試驗在表型標記（低CD25及GzmB）之外是否具有可比性宠互，我們對體外啟動的T細胞進行了單細胞RNA測序味榛，并分析了在存在或不存在Treg細胞的情況下，由DC1s啟動的CD8+ T細胞之間的差異表達基因

• Treg細胞的存在導致GzmB予跌、Il2ra搏色、Il12rb1和Il12rb2表達減少（與效應因子功能相關的轉錄本），并導致CD8+ T細胞上與抑制效應T細胞分化（Sell匕得、Pecam1继榆、Lef1巾表、Tcf7I汁掠、S1pr1、S1pr4）和T細胞命運決定（Klf2集币、Klf3）相關的轉錄本表達增加

在存在或不存在Treg細胞的情況下考阱，體外T細胞實驗的轉錄譜分別與已知的mLN或iLN的RNA測序一致。

小結論：因為不管是體外還是體內鞠苟，這種表達的情況是一致的乞榨，說明T細胞的這種啟動是保守的。

接著呢当娱，作者就評估了一下mLN和iLN中的Treg的一個抑制能力吃既，然后就發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)中的Treg也是抑制了CD8+ T細胞CD25和GzmB的表達。這和表達的情況是一致的跨细。同時mLN里的更厲害一點鹦倚。

圖片.png

另外，Treg細胞固有抑制能力的組織特異性差異僅在DC1+Treg+OT-I T細胞共培養(yǎng)中被檢測到冀惭，因為基于aCD3/ acd28的共培養(yǎng)顯示出類似的抑制（附圖偷懶）震叙。

為了比較mLN和iLN Treg細胞在受控環(huán)境下的DC抑制效果，我們建立了來自p40-IRES-eYFP IL-12報告小鼠骨髓的成熟骨髓來源的DC （BMDC）和來自mLN和iLN的Treg細胞的共培養(yǎng)散休。

• 省流：這個小鼠就是報告IL-12的媒楼，之前那個應該是一個報告基因元件？

與前文結果一致戚丸， mLN和iLN的Treg細胞都抑制了BM-DC上CD80和CD86的表達划址，另外，mLN Treg細胞更有效地抑制CD80和CD86的表達限府。

小理解：前文一個是KP鼠夺颤，一個是Treg耗竭鼠，這兒是整出來共培養(yǎng)谣殊。

圖片.png

但是拂共，iLN來源耳朵TregTreg細胞誘導IL-12抑制比mLN是更強的(圖4K)，這與第二節(jié)中的情況是相反的（體內應該是MLN抑制更強）姻几。

小解釋：這種差異可以解釋為在本實驗中缺乏效應T細胞宜狐，因為T細胞衍生的IFN-g誘導IL-12表達势告。

圖片.png

背景：DC來源的刺激信號不足會阻止CTL產(chǎn)生。
前文說Treg通過抑制DC1產(chǎn)生的信號2和3來引起mLN中CD8+ T細胞的功能異常抚恒。那么補充信號2和3是不是可以真就CTL的產(chǎn)生咱台？

體外：然后就體外進行ZsG+ DC1+Treg+OT-I T細胞共培養(yǎng)，分別加抗CD28和IL-12俭驮。結果發(fā)現(xiàn)加了抗CD28和IL-12可以讓CDC25和GzmB部分高表達（CTL部分恢復）回溺。然后同時加倆可以讓CTL完全恢復。
體內：接著在荷瘤小鼠的mLN中評估CD8+ T細胞的啟動情況混萝，也是加抗CD28和IL-12遗遵，然后發(fā)現(xiàn)也是CD25和GzmB表達增加

圖片.png

小總結：在mLN中，Treg細胞對DC1產(chǎn)生的刺激信號（2&3）的抑制增強逸嘀，導致CD8+ T細胞出現(xiàn)功能失調（不當CTL了）车要。

Treg cells suppress CD8+ T cell priming in the mLN via direct interaction with DC1s

Treg細胞通過直接與DC1s相互作用抑制mLN中的CD8+ T細胞引物。

一個背景知識：Treg細胞能以接觸依賴或非接觸依賴的方式抑制DC刺激分子崭倘。為了首先評估CD8+ T細胞啟動過程中Treg細胞和DC1s的空間排列翼岁，我們對過繼移植CD45.1+ OT-I T細胞后的XCR1 DRT小鼠中的mLN及iLN進行了免疫熒光（IF）染色。(圖5A)司光。

• 這是個什么鬼小鼠：XCR1 DTR小鼠
• DTR 小鼠是通過基因編輯讓目的細胞表達白喉毒素受體（Diphtheria toxin receptor琅坡，簡稱DTR），然后通過注射白喉毒素（Diphtheriatoxin残家，簡稱DT）實現(xiàn)細胞的條件性剔除榆俺。
• XCR1+交叉呈遞DC1細胞

這個坑回頭看心情填不填吧

分別使用內源性Venus信號、CD45.1和FoxP3標記鑒定了XCR1+ DC1s跪削、腫瘤反應性OT-I T細胞和Treg細胞谴仙。我們將分析重點放在OT-I T細胞微孔上。（定義：包含至少一個DC1的OT-I T細胞簇為中心的圓形區(qū)域）

我說婷婷：就是大概就是Treg和DC1作用在CD8+ T細胞上碾盐，那么就是以T細胞為中心晃跺，看看Treg和DC1到他的距離。

圖片.png

評估指標：測量Treg細胞到其最近的DC1的距離來評估Treg和DC1的接近性毫玖。
結果：mLN中微池相關的Treg細胞和DC1s彼此更接近（圖5B, 5C）掀虎。在mLN中，Treg細胞和DC1s的這種空間接近是微孔特異性效應付枫，因為在微孔外烹玉，Treg和DC1的距離增加了（圖5C）。mLN和iLN中的微孔大小相似阐滩，mLN中微孔內Treg和DC1的比例也沒有增加（圖5D）二打。
（量沒變多，但是距離近了）

小結論：mLN中Treg細胞抑制的增加可能是由Treg細胞和參與腫瘤特異性CD8+ T細胞激活的DC1s的物理接近所驅動的掂榔。（就是靠得近所以產(chǎn)生作用）

圖片.png

靠得近就起作用继效，那是不是要靠在一起捏症杏？
為了測試Treg細胞介導的DC1s抑制是否需要直接的細胞接觸，文章阻止了兩種細胞之間MHC-II依賴性的相互作用瑞信±鞑抗體介導的MHC-II在體外ZsG+ DC1:Treg:OT-I T細胞共培養(yǎng)中完全逆轉了Treg細胞抑制表型，這表明DC1s上的MHC-II可達性對于Treg細胞介導的CD8+ T細胞啟動抑制至關重要凡简。

小理解：就是用MHC-II抗體分子給進去逼友，就會逆轉Treg的抑制作用。就是DC1上的MHC-II和Treg相互作用引起抑制秤涩。

圖片.png

為了測試MHC-II消融對體內DC1刺激能力的影響帜乞，我們生成了WT:H2-Ab1 -/- 混合骨髓嵌合體（BMC）（兩種都有），并比較了mLN中野生型（WT）和H2-Ab1 -/- ZsG+ DC1s的表型(圖5G, S2L和S2M)溉仑。MHC-II缺失導致體內ZsG+ DC1s上CD80挖函、CD86和IL12的表達增加.

• H2-Ab1：MHC II特征基因

小理解：敲掉特征基因状植，MHC-II表達不行了浊竟，那么就不抑制了，然后T細胞激活的幾個因子就增加津畸。

圖片.png

小結論：Treg細胞介導的抑制作用是通過MHC-II依賴的相互作用傳遞給DC1s的。

接著這種DC1特異性的MHC-II缺失對CD8+ T細胞的啟動有什么影響呢？

我們生成了

• WT
• Batf3 -/- : WT
• Batf3 -/- : H2-Ab1-/- 混合骨髓細胞

以比較MHC-II+ DC1s（在WT和Batf3 -/- : WT骨髓細胞中）和MHC-II - DC1s （在Batf3-/- : H2-Ab1 -/- 骨髓細胞中）對CD8+ T細胞啟動的影響逢享。

-Batf3：缺乏Batf3表達作用的T細胞能夠正常增殖和分化竞穷，但隨后數(shù)量急劇下降，記憶反應減弱暖途。反之亦然卑惜，BATF3的過度表達延長了了CD8+ T細胞的存活時間并促進了它們向記憶的轉變。這是由于在信號通路當中驻售，BATF3通過促凋亡因子BIM調控著T細胞的凋亡和存活露久。而如果能夠對這一機理加以應用，那么就可以對CD8+T細胞的存活和記憶進行編程和修飾欺栗，從而延長這一腫瘤免疫關鍵細胞的作用時間毫痕，使腫瘤免疫反應能夠抵御未來的威脅。

Batf3 -/- : H2-Ab1 -/- BMC中DC1特異性MHC-II缺失與對照BMC相比恢復了mLN中CTL的啟動(圖5K)迟几。(缺MHC-II可以逆轉CTL的生成)

我們使用XCR DTR : WT和XCR DTR : H2Ab1-/-混合BMC中也獨立驗證了這一結果消请。（加DT去除DC1之后，也可以逆轉這種功能（DC1特異性MHC-II缺失可以導致mLN中CTL的有效啟動）类腮。

圖片.png

小結論：因此臊泰，在肺腫瘤中，MHC-II 依賴的Treg:DC1相互作用導致DC1抑制和相關的CD8+ T細胞功能障礙蚜枢。
（主要證明了MHC-II的依賴）

（累死）

Th1-like Treg cells expand in tumor-draining mLNs

Th1樣Treg細胞在mLN中擴增缸逃。

前文感覺已經(jīng)講了講DC1和Treg細胞大概是咋樣去抑制CTL的出現(xiàn)以及功能失調CD8+ T細胞如何產(chǎn)出七婴。但是，目前尚不清楚是什么組織特異性因素導致Treg細胞在mLN中比iLN中更具有抑制作用察滑。
等于現(xiàn)在是要比較一下mLN和iLN之間的一個情況了打厘。

背景：抑制的增加通常與Treg細胞豐度增加相關

所以首先作者比較了mLN和iLN中的Treg細胞量，沒啥差異

圖片.png

另外贺辰，SIIN反應性CD8+ / Treg細胞比率與mLN中觀察到的抑制增加無關（附圖偷懶）户盯。

小背景：Treg細胞是異質的，具有不同的組織特異性功能特化和TCR庫饲化，這可能影響它們的抑制能力莽鸭。

所以感覺就是想看是不是這種組織異質性導致了Treg在mLN中得抑制增加。

為了表征它們的轉錄狀態(tài)吃靠，我們對從荷瘤小鼠和naive小鼠的mLN和iLN中分選出來的Treg細胞配對進行了scRNA-seqT細胞受體測序（TCR-seq）硫眨。

小結果：

• 我們獲得了16,249個Treg細胞的高質量轉錄組，并從55.4%的細胞中恢復（recovered巢块？）了TCR-β序列礁阁，從23.1%的細胞中恢復了TCR-α序列，從14.4%的細胞中恢復了TCR-β和TCR-α配對序列族奢。（附圖偷懶）
• 最初的無監(jiān)督分析確定了四簇Treg細胞姥闭，我們隨后重點分析了三簇活化的Treg細胞，這些細胞表現(xiàn)出與naive T細胞相關的標記和基因集表達減少越走。

在被激活的Treg細胞中棚品，我們發(fā)現(xiàn)了四個簇：

• 富集與早期激活相關的轉錄本的Treg細胞（Nr4a1, Egr1, Egr2, Myc, Dusp）
• 富集與早期增殖相關的轉錄本的Treg細胞（Mki67, Top2a, Stmn1, Cenpf, Birc5）
• 兩個被激活的Treg細胞簇
  • 激活簇1（C1）：Cxcr3, Icos, Tigit, Prdm1, Ctla4
  • 激活簇2（C2）：Rorc, Ccr6, Il10ra, Il18r1, Tgfbr2

圖片.png

與原始LN相比，活化的C1在兩種tdLN中都顯著富集廊敌，這表明該轉錄程序是對腫瘤的反應（附圖偷懶）铜跑。

背景：Treg細胞可以以抗原特異性的方式抑制，并在對腫瘤的反應中進行克隆擴增骡澈。

我們評估了它們的克隆擴增锅纺。Treg細胞在兩種tdLN中均有克隆擴增，但在兩種naive LNs中均無克隆擴增秧廉。mLN和iLN的整體克隆擴增程度相當伞广，且這種擴增僅限于活化的C1 Treg細胞簇。

圖片.png

以下為附圖偷懶時間

為了評估Treg細胞的特異性（C1簇活化）疼电，我們分析了活化的C1 Treg細胞中的CDR3序列嚼锄。

• CDR3：由V(D)J結編碼的序列稱為互補決定區(qū)域3或CDR3。這個序列在α鏈和β鏈中都具有最高的可變性（variability）蔽豺，決定了T細胞識別MHC分子所呈現(xiàn)的抗原肽的能力区丑。

多個小鼠的Treg細胞中獨立恢復了四個公共TCR-β序列，這個序列在mLN和iLN中共享。這些序列由不同的核苷酸重排形成沧侥，證明了TCR序列的收斂性可霎。同時與其他CDR3-β序列相比，這些序列更有可能表現(xiàn)出克隆擴增宴杀，并且在naive iLN或mLN中完全不存在癣朗，盡管序列恢復程度相當。

小結論：這里分析的Treg細胞對兩種tdLN中存在的腫瘤相關抗原有反應旺罢。雖然這些數(shù)據(jù)并不排除TCR保留序列差異可能影響Treg細胞抑制能力的可能性旷余，但他們認為TCR以外的特征可能在調節(jié)Treg細胞抑制功能方面起主導作用。

激活的C1 Treg細胞的表型與功能抑制能力的增加相關扁达，那么mLN和iLN中的C1 Treg細胞之間的轉錄是否有差異正卧？

分析了一下

• mLN中激活的C1 Treg細胞的轉錄本，可以發(fā)現(xiàn)其中激活的基因有：
  • 免疫抑制相關：Nrp1, Fgl2和Nt5e
  • IFN反應和Th1極化相關：Ifngr1, Cxcr3, Tbx21, Cybb和Ptpn11
• iLN富集的轉錄本有：
  • T細胞激活相關：Icos和Gcnt1
  • Treg細胞存活和穩(wěn)定性相關：Cd2和Satb1跪解。

圖片.png

由于Th2樣Treg細胞可以有效抑制抗腫瘤免疫（那這種C1型的Treg會不會是Th2樣的呢炉旷？），作者檢測了典型的Th1-叉讥、Th2-和TH17-極化轉錄因子（Tbx21窘行、Gata3和Rorc）在活化的C1 Treg細胞上的表達。在所有mLN中节吮，Tbx21表達一致增加抽高，而Gata3和Rorc表達相似（附圖偷懶）。

小結論：激活的c1 Treg細胞在腫瘤引流mLN中Th1極化透绩。

兩種tdLN中Treg細胞的進一步流式結果顯示

• 來自mLN的Treg細胞上天然Treg細胞標記物neuro-pilin 1 （NRP1）和Helios增加
• PD-1和CTLA-4的表達增加(圖6I, 6J, S4A和S4B)。
• 抑制分子NRP1壁熄、CTLA-4帚豪、CD39和CD73在mLN Treg細胞上差異表達
• 轉化生長因子β-1（TGF-β1）和CD25在iLN Treg細胞上高表達

圖片.png

小結論：說明啥呢？說明兩種tdLN的抑制模式存在一些不同草丧。

繼續(xù)觀察結果：

• Ki67和FoxP3表達相似狸臣。
• 與scRNA-seq結果一致，Th1樣標記CXCR3和T-bet在mLN Treg細胞上有差異表達(圖6K)昌执。
• 對T-bet烛亦、Gata3和RORgt表達的分析證實了Th1極化，與iLN相比懂拾，mLN中T-bet在大批量的測序和CD44+ CD62L效應Treg（eTreg）細胞上表達最高煤禽，并且T-bet+ CXCR3+ Th1樣eTreg細胞在mLN中的頻率增加。

圖片.png

小結論：mLN中的Treg細胞獲得了一種Th1樣效應表型岖赋，富集在一組不同的抑制分子中檬果。

前文說了Treg細胞直接與mLN中的DC1s相互作用，那么久要看DC1s是否調節(jié)Treg細胞的反應。在WT和Batf3-/-小鼠中选脊，Treg細胞表達PD-1和CTLA-4相似杭抠，但在沒有DC1s的情況下，T-bet降低恳啥，T-bet+ CXCR3+ th1樣eTreg細胞的頻率降低偏灿。因此，mLN中eTreg細胞的Th1極化需要DC1s钝的。（附圖偷懶）

前文發(fā)現(xiàn)菩混，與iLN相比，IFN調控的轉錄物和蛋白質優(yōu)先在mLN的Treg細胞上表達扁藕，我們假設IFN在mLN中誘導Th1樣Treg細胞的生成沮峡。

我們使用WT：Ifnar1-/-、WT：Ifngr1-/-和WT：Ifngr1-/-Ifnar1-/- 混合共培養(yǎng)的BMC亿柑，來比較mLN中WT和IFN受體缺失 Treg細胞的表型邢疙。雖然Ifnar1的缺失導致T-bet的適度降低，對Treg細胞上CXCR3的表達沒有影響望薄，但Ifngr1的缺失導致T-bet和CXCR3表達的嚴重降低疟游，與已發(fā)表的數(shù)據(jù)一致。

盡管FoxP3痕支、CD25颁虐、PD-1、CTLA-4和CD73的表達不受IFN受體缺失的影響卧须，但在mLN中Ifngr1缺陷的Treg細胞上另绩，CD39表達降低（附圖偷懶）。Th1標記物和CD39在Treg細胞上的表達很大程度上依賴于腫瘤引流mLN中IFN-g的感知花嘶。

圖片.png

然后笋籽，我們測試了Th1樣eTreg細胞的誘導是否同樣依賴于兩種tdLN中的IFN感應。我們生成了FoxP3 DTR.eGFP：Ifnar1-/-椭员，F(xiàn)oxP3 DTR.eGFP：Ifngr1-/-车海， FoxP3 DTR.eGFP：Ifngr1-/-Ifnar1-/- 混合BMC，并比較mLN和iLN中供體來源的WT和IFN受體缺陷（KO）eTreg細胞的表型隘击。

這些BMC使我們能夠排除宿主來源的Treg細胞（WT）侍芝，并驗證這些抗輻射細胞沒有混淆我們的分析。與之前對整體的Treg細胞的分析一致（上圖B）埋同，T-bet和CXCR3在mLN中的eTreg細胞表達依賴于IFN-γ感知州叠。同樣，Ifngr1的敲除使iLN中eTreg細胞上的T-bet和CXCR3表達變少（莺禁？）留量。盡管T-bet+ CXCR3+ th1樣eTreg細胞優(yōu)先富集于mLN的WT免疫部分，當Ifngr被敲除時，它們的表達在mLN和iLN之間是相當?shù)穆ハāＲ虼艘浯拢琓h1樣eTreg細胞程序在兩種LNs中都依賴于IFN-γ，但它主要是在mLN的Treg細胞中誘導的可岂。（附圖偷懶）

由于Th1樣eTreg細胞的誘導依賴于IFN-γ的感應错敢，我們假設mLN特異性富集在Th1樣eTreg細胞中可能是由于IFN-γ豐度的組織特異性差異造成的。事實上缕粹，與iLN相比稚茅，腫瘤引流mLN中IFN-g的含量增加了3.78倍-。相比之下平斩，兩中tdLN之間IL-2豐度基本相似（附圖偷懶）亚享。

圖片.png

此外，來自naive LNs的IFN-γ測量結果與來自tdLN的IFN-γ測量結果一致绘面，在naive小鼠中欺税，與匹配的iLN相比，mLN中的IFN-γ更豐富揭璃。

mLN特異性的IFN-γ富集與腫瘤本身無關晚凿，由LN的解剖位置決定。由于肺微生物依賴的IFN信號可以影響肺特異性免疫瘦馍，我們測試了IFN-g的組織特異性差異是否會在無菌（GF）小鼠中維持歼秽。與無特異性病原體（SPF）小鼠不同，naive GF小鼠的mLN和匹配iln中IFN-g的量是相等的情组。因此燥筷，觀察到的IFN-γ的mLN特異性豐度是由共生細菌的存在引起的

圖片.png

mLN-specific enrichment in IFN-g drives induction of Th1-like Treg cells and the associated dysfunctional T cell responses against lung cancer

IFN-g中的mLN特異性富集驅動Th1樣Treg細胞的誘導和相關的功能失調T細胞對肺癌的反應。

背景：前文研究說了mLN中的Treg細胞表達趨化因子受體CXCR3呻惕，既往研究又說了CXCR3指導效應T細胞在淋巴結內定位荆责，并促進與DC的相互作用。

所以就想看CXCR3在功能上是否對Treg細胞抑制肺腫瘤的CTL反應是必需的

我們生成了FoxP3 DTR：WT和FoxP3 DTR：CXCR3 -/- 混合BMC亚脆。用來比較CXCR3缺陷Treg細胞（FoxP3 DTR：CXCR3 -/- BMC）和WT Treg細胞（FoxP3 DTR：WT BMC）對CD8+ T細胞啟動的抑制作用。
結果顯示：Treg細胞特異性缺失CXCR3對腫瘤引流mLN中的CD8+ T細胞表型沒有影響盲泛，這表明幾種冗余的趨化因子受體/配體通路可能促進Treg:DC通信濒持。（不止CXCR3影響通信）

前文作者發(fā)現(xiàn)：IFN-γ細胞因子和IFN-γ依賴的Th1樣Treg細胞在mLN中富集
這兒就想測試IFN-γ感知是否可以調節(jié)Treg細胞抑制CTL啟動的能力。

本文生成了FoxP3 DTR：WT和FoxP3 DTR：Ifngr1 -/- 混合BMC寺滚，以評估Ifngr1缺陷的Treg細胞（FoxP3 DTR：Ifngr1 -/- BMC）或WT Treg細胞（FoxP3 DTR：WT BMC）對mLN中CD8+ T細胞啟動的影響柑营。

小結果：與對照組相比，Treg細胞上的Ifngr1消融導致mLN中引物的CD8+ T細胞上CD25表達增加村视。這2.24倍的增加（±0.374 SEM）與前文中（最前面一張圖官套，吐了）iLN-和mLN-引物T細胞之間CD25表達的3.32倍差異（±0.947 SEM）相當。

盡管GzmB和TIM3/TCF1的表達沒有變化(圖7I和S6H)，但部分挽救也是很好的奶赔，因為FoxP3 DTR:Ifngr1 -/- bmc中大約一半的免疫細胞存在Ifngr1缺失惋嚎，包括DC1s，它依賴于IFN-g產(chǎn)生IL-12站刑。在沒有DT處理的情況下另伍，在FoxP3 DTR：WT和FoxP3 DTR：Ifngr1-/- BMC的mLN中啟動的CD8+ T細胞表現(xiàn)出不變的CD25表達，說明這種拯救效果是由Treg細胞特異性的IFN-γ感知消融所驅動的绞旅。

圖片.png

然后摆尝，我們評估了抗體介導的IFN-γ阻斷是否可以對抗mLN中富含IFN-γ的環(huán)境，并重新連接Treg細胞極化和CD8+ T細胞啟動因悲。

IFN-γ介導CTL抑制堕汞，那么阻斷IFN-γ能不能抑制啟動？

既往研究報道了IFN-γ在CD8+ T細胞效應分化中發(fā)揮重要作用晃琳，我們在腫瘤植入后早期使用IFN-γ阻斷劑（不讓在mLN中產(chǎn)生）讯检，并評估過繼轉移T細胞的啟動作用（給T細胞看能不能激活）。IFN-γ阻斷導致腫瘤引流mLN中OT-I T細胞CD25蝎土、GzmB和TIM-3表達增加视哑，但對iLN無影響，說明這種免疫調節(jié)是組織特異性的誊涯。

IFN-g阻斷導致mLN和iLN Treg細胞中T-bet表達降低挡毅，而Treg細胞總數(shù)保持不變。短暫的IFN-g阻斷足以挽救CTL啟動暴构，并改變腫瘤引流mLN中富含IFN-g環(huán)境中的Treg細胞表型跪呈。

圖片.png

• T-bet：TBX21編碼了一個重要的免疫轉錄因子（T-bet）。自從2000年被Laurie H. Glimcher組發(fā)現(xiàn)以來取逾，T-bet轉錄因子被廣泛的研究耗绿。T-bet是調控1型輔助T細胞 （TH1）的最重要的轉錄因子。后來砾隅，T-bet被發(fā)現(xiàn)也在先天免疫系統(tǒng) (innate immunity)和先天樣淋巴細胞(innate-like adaptive lymphocytes)起到關鍵作用误阻。

為了研究IFN依賴性Th1樣Treg細胞是否與人類抗腫瘤免疫減弱相關，我們重新分析了來自人類黑色素瘤的腫瘤浸潤T細胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)集晴埂。在這些患者中究反，IFN反應程序和TBX21或CXCR3轉錄本的9Treg細胞表達與ICB耐藥密切相關。

CD8+ /Treg細胞比例與ICB反應無關儒洛，這表明Treg細胞的質量而不是數(shù)量決定了抗腫瘤免疫的結果精耐。結合我們發(fā)表的肺癌特異性CD8+ T細胞功能障礙導致ICB耐藥的發(fā)現(xiàn)，這些數(shù)據(jù)表明IFN-γTreg細胞與人類和小鼠的ICB耐藥相關琅锻。

小結一下

沒啥想說的卦停，免疫文章太難了向胡。、