引物純化方式
- PAGE純化：
PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳霍弹，對引物DNA進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA锐想。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法然走，純化后的DNA純度大于90%，對長鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效决瞳。 - HPLC純化：
HPLC純化是使用高效液相色譜的原理咬展，對引物DNA進行純化。該方法用于分離純化或分析時能達到很高的純度和靈敏度瞒斩。在引物DNA的分析和純化中破婆，常用的有離子交換（ion-exchange）HPLC和反相（reverse-phase）HPLC。純化后胸囱，引物的純度可大于90% 祷舀。特別適合用于短鏈（小于40 mer）引物和修飾引物的純化。
優(yōu)點：對純化短鏈引物(＜40 mer)特別有效，缺點：成本高裳扯，批量生產(chǎn)效率不高抛丽。如實驗對純度要求非常高，建議選用HPLC與hPAGE雙重精制饰豺。純度大于90%亿鲜；ion exchange HPLC：純度大于95%，可以有效的去除N-1短片段冤吨。HPLC純化主要用于短鏈和修飾引物的純化蒿柳。該法的缺點是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高漩蟆。 -
RPC純化
RPC純化是通過反相凈化濾芯(Reverse Phase Cartridge)對引物進行純化垒探，純化原理與反相HPLC純化一樣。與反相HPLC比較怠李，RPC是一種有效且更加經(jīng)濟的純化方式圾叼。反相凈化濾芯通常包含一種疏水基質(zhì)如C18的硅膠，能夠很好的吸附DNA捺癞，并且可以用水輕松地將切割下來的保護基團和短的引物片段從反相柱上洗掉夷蚊。RPC純化的引物可以應用于DNA測序、PCR及基因合成等髓介。
金斯瑞生物科技
mer(monomeric unit)是雙鏈核酸中的單位撬码，意即單體單元，相當于nt或者BP都可以版保。通常用于雙鏈核酸中的單位，100 mer DNA相當于每一條鏈有100nt夫否。
- HAP純化（HIGE AFFINITY PURIFICATIION）
HAP方法是生工自主開發(fā)的新型oligo DNA純化方法彻犁。用HAP純化的引物純度可達98%以上，完全可與PAGE凰慈、HPLC方法媲美汞幢。 其原理是利用合成引物5’-端DMT基團對HAP樹脂專一性吸附、而不含DMT的短鏈DNA不被吸附微谓，從而達到分離純化的目的森篷。
HAP方法的三大優(yōu)勢：
- 純度高。用其純化所得引物的純度高達98%以上 (見圖1)豺型≈僦牵可用于絕大多數(shù)分子生物學實驗。
- 快速姻氨。用HAP方法純化的引物一輪只需2小時钓辆，因而可比PAGE方法提前一天交貨，節(jié)約您更多寶貴時間。
- 價格上更有競爭優(yōu)勢前联。由于HAP方法與PAGE功戚、HPLC方法相比速度快、成本低似嗤，從而節(jié)約科研經(jīng)費啸臀。 HAP引物的用途 用HAP方法純化的引物可用于絕大多數(shù)分子生物學實驗，包括DNA測序烁落、基因合成乘粒、PCR反應、點突變顽馋、分子雜交和基因芯片技術(shù)等谓厘。
Oligo退火：上游+下游引物制備雙鏈DNA
定義
所謂“退火（Annealing）”，是指將材料暴露于高溫環(huán)境中持續(xù)一段時間寸谜，再緩慢冷卻到低溫的熱處理步驟竟稳。
對于Oligo來講，退火過程的主要目的是用于形成DNA的高級結(jié)構(gòu)熊痴，如莖環(huán)他爸、發(fā)夾、雙鏈或其他結(jié)構(gòu)果善。
步驟
- 溶解oligo
拿到oligo干粉產(chǎn)品之后诊笤，對管子進行瞬時離心，加入退火緩沖液進行溶解巾陕。
推薦溶解成比較高的濃度讨跟，建議100 μM以上濃度。如oligo因濃度較高而不溶解鄙煤，可以加熱并攪拌促溶晾匠。 - 濃度測定&混合
精確測定每個Oligo溶液的濃度，并按照需要的比例進行混合（如等摩爾混合）梯刚。如果兩條oligo退火形成雙鏈凉馆，摩爾數(shù)不同會導致多余的單鏈殘留。單鏈發(fā)夾或莖環(huán)的退火可跳過此步驟亡资。 - 退火
將混合體系加熱至94°C澜共，持續(xù)2 min，然后緩慢降溫（一般情況下將至室溫即可）锥腻。緩慢降溫對形成正確的結(jié)構(gòu)是非常有幫助的嗦董，降溫過快將導致錯誤高級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，推薦的方法是將混合管放入一杯94°C的水中瘦黑，讓其自然降至室溫展懈。 - 稀釋&儲存
降溫之后销睁，可以用退火緩沖液稀釋至需要的濃度并儲存于-20°（長期）或4°C（短期內(nèi)頻繁使用）。
注意
退火緩沖液的配制
退火緩沖液配方：10 mM Tris, pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA
其中：tris起到pH緩沖作用存崖，EDTA起到防止oligo降解的作用冻记，鹽離子對于DNA雙鏈的形成是必要的。
配制退火緩沖液来惧，需要高溫滅菌冗栗，并使其中的脫氧核糖核酸酶失活，如果用于siRNA退火供搀，需要保證RNase-free.
適用性
該方法適用于常規(guī)oligo隅居、2-甲氧基修飾、鎖核酸等高級修飾的oligo以及短鏈RNA的退火葛虐。
退火效率檢測
可以通過非變性PAGE膠對變性前的單鏈oligo以及變性之后的雙鏈oligo同時進行電泳胎源，判斷是否退火成功，通常情況下屿脐，鏈長較短時涕蚤，相同長度的單鏈比雙鏈DNA的遷移速度要快。但長鏈oligo由于其本身容易形成高級結(jié)構(gòu)的诵，不推薦進行非變性電泳万栅。
