??SDS-PAGE是蛋白質(zhì)分析與鑒定最常用的方法之一蚂会，它的特點(diǎn)是一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)與遷移率線性相關(guān)脂新，基于這一點(diǎn)厌漂，很多技術(shù)人員把SDS-PAGE作為定量檢測(cè)分子量的手段槽地。實(shí)際上号阿，蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中的表觀分子量與實(shí)際分子量往往有偏差并鸵，本文主要聊聊包括分子量偏差在內(nèi)的三個(gè)問題：
- 不同蛋白質(zhì)之間能進(jìn)行分子量比較的原理
??關(guān)于SDS-PAGE的原理，網(wǎng)上有很多扔涧，千篇一律：在聚丙烯酰胺凝膠中园担，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率與電荷和體積有關(guān)，SDS與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物枯夜，大量SDS所攜帶負(fù)電荷掩蓋了蛋白質(zhì)原有電荷弯汰，并且蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合體具有相似的形狀（類似雪茄煙的棒狀顆粒，我個(gè)人認(rèn)為應(yīng)該比喻為橄欖球狀）湖雹，電荷的差異消除了咏闪，形狀也相似，那只有分子量這一個(gè)變量了摔吏。分子量大的鸽嫂，“個(gè)頭”大，在凝膠中“行動(dòng)遲緩”征讲，分子量小的据某，“個(gè)頭”小，遷移速率快稳诚。實(shí)驗(yàn)證明哗脖，在一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的遷移速率與分子量的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。
這里有幾篇文獻(xiàn)，介紹了SDS-PAGE技術(shù)是如何確立的：
[1] Laver W G. Structural studies on the protein subunits from three strains of influenza virus[J]. Journal of molecular biology, 1964, 9(1): 109-IN9.
研究人員使用SDS將三種病毒蛋白的亞基解離并通過電泳進(jìn)行鑒別（這是作者找到的最早使用SDS-PAGE分析多肽鏈的文獻(xiàn)）
[2] Shapiro, A. L., Vi?uela, E., & V. Maizel, J. (1967). Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochemical and Biophysical Research Communications, 28(5), 815–820.
這篇文獻(xiàn)就是SDS-PAGE技術(shù)的起源了才避，Shapiro等研究了十幾種蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中的遷移距離橱夭，發(fā)現(xiàn)遷移率與分子量對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。
[3] Pitt-Rivers R, Impiombato F S A. The binding of sodium dodecyl sulphate to various proteins[J]. Biochemical Journal, 1968, 109(5): 825-830.
研究了不同類型蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的數(shù)量比例關(guān)系桑逝。
[4] Reynolds J A, Tanford C. The gross conformation of protein-sodium dodecyl sulfate complexes[J]. Journal of Biological Chemistry, 1970, 245(19): 5161-5165.
研究了蛋白質(zhì)-SDS的構(gòu)象及其流體動(dòng)力學(xué)性質(zhì)棘劣，給出了遷移速率與分子量線性關(guān)系的物理學(xué)解釋。
[5] Mattice W L, Riser J M, Clark D S. Conformational properties of the complexes formed by proteins and sodium dodecyl sulfate[J]. Biochemistry, 1976, 15(19): 4264-4272.
主要從二級(jí)結(jié)構(gòu)上解析SDS-PAGE復(fù)合物構(gòu)象楞遏，比較了不同復(fù)合物模型茬暇，提出新的模型解釋SDS-PAGE中部分堿性蛋白表觀分子量偏低的原因。
??SDS-PAGE是從上世紀(jì)60年代初發(fā)展起來的一種蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)寡喝，當(dāng)時(shí)主要用于病毒蛋白糙俗、糖體蛋白和血清蛋白的研究[1]。1967年预鬓，Shapiro等[2]將該技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量分析巧骚，此后這種方法逐漸普遍起來。在研究中格二，Shapiro等先用1%的SDS處理蛋白質(zhì)劈彪，再通過透析置換到0.1%SDS的磷酸緩沖液中，最后在0.1%SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳顶猜，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色得到蛋白質(zhì)的遷移結(jié)果沧奴，他們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的遷移速率與分子量對(duì)數(shù)之間存在很好的線性擬合，如下圖：
Shapiro, A. L., Vi?uela, E., & V. Maizel, J., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1967, 28(5), 815–820.
??1968年长窄，ROSALIND等[3]等研究發(fā)現(xiàn)滔吠，在一定pH和鹽離子濃度下，SDS結(jié)合蛋白質(zhì)具有比較固定的比例挠日，并且這一比例與蛋白質(zhì)種類有關(guān)：對(duì)于部分糖蛋白屠凶，1g蛋白質(zhì)結(jié)合0.7~1g SDS；對(duì)于不含二硫鍵的蛋白肆资，1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS；含有二硫鍵的蛋白質(zhì)灶芝，1g蛋白質(zhì)結(jié)合0.7~0.9g SDS郑原，二硫鍵被還原后，1g蛋白結(jié)合1.4g SDS夜涕。1970年犯犁，Reynolds等研究了SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，分析了“棒狀”復(fù)合物的流體動(dòng)力學(xué)特征女器，得出復(fù)合物的特征粘度與分量子存在指數(shù)關(guān)系酸役，可以進(jìn)一步推導(dǎo)出復(fù)合物的斯托克斯半徑的對(duì)數(shù)與分子量對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。這幾篇論文基本上奠定了SDS-PAGE的理論基礎(chǔ)，感興趣的同學(xué)可以好好看看涣澡。 -
表觀分子量大于或小于實(shí)際分子量的成因
??在SDS-PAGE上遷移率發(fā)生異常贱呐，是家常便飯，不論是酸性蛋白還是堿性蛋白入桂，都會(huì)因?yàn)樗鼈兊墓逃须姾筛淖兞薙DS-PAGE的荷質(zhì)比而偏離正常值奄薇。一般認(rèn)為，酸性蛋白富含負(fù)電荷可能遷移較快抗愁，堿性蛋白質(zhì)可能遷移較慢馁蒂，事實(shí)并非如此，比如上圖中蜘腌，RNase A和溶菌酶表觀分子量都小于實(shí)際分子量沫屡，這兩個(gè)蛋白質(zhì)都屬于堿性蛋白。為什么出現(xiàn)這樣的偏差呢撮珠？Mattice等[5]在他們的模型中給出了解釋：RNase A沮脖、組蛋白等堿性蛋白與SDS形成復(fù)合物后，仍含有大量緊密的螺旋結(jié)構(gòu)而不是松散的無規(guī)則卷曲倘潜，緊密的構(gòu)型使復(fù)合物在凝膠中有更小的阻力，因此遷移的更快志于。這一研究也表明涮因，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物并非都是無差別的“棒狀”結(jié)構(gòu)，這樣導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)分子量對(duì)數(shù)與遷移率有更復(fù)雜的關(guān)系伺绽。
??用SDS-PAGE評(píng)估相對(duì)分子量是需要嚴(yán)格條件的：1）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)养泡、氨基酸構(gòu)成要接近，ROSALIND等的研究已經(jīng)證明奈应，不同的蛋白質(zhì)結(jié)合SDS的能力是不同的澜掩，使用相同的條件處理不同類型的蛋白質(zhì)，遷移偏差是必然的杖挣；2）蛋白質(zhì)要處于相同的溶劑環(huán)境肩榕，有些樣品處于高鹽溶液，有些處于低鹽環(huán)境惩妇，有時(shí)pH也有極大差異株汉，即使經(jīng)過相同的SDS-PAGE loading buffer處理，蛋白質(zhì)結(jié)合SDS-PAGE的情況也可能有很大差別歌殃；3）分子量參照的影響乔妈，現(xiàn)在很多蛋白質(zhì)marker使用預(yù)染色marker，有色染料會(huì)在一定程度上影響遷移的準(zhǔn)確性氓皱，如果需要比較準(zhǔn)確的估算相對(duì)分子量路召，推薦使用非預(yù)染色marker勃刨。
??此外蛋白質(zhì)修飾也會(huì)影響遷移率，通彻傻可以見到磷酸化導(dǎo)致蛋白質(zhì)的遷移減慢身隐，雖然磷酸根增加了蛋白質(zhì)的負(fù)電荷，但多半由于構(gòu)象變化和電荷排斥導(dǎo)致SDS結(jié)合減少揣非，遷移減慢抡医，這種情況一般經(jīng)過去磷酸化處理后，遷移速率能夠恢復(fù)早敬。另一種典型的修飾是糖基化修飾忌傻，這個(gè)影響很大，除了糖基化蛋白質(zhì)結(jié)合SDS的能力下降外搞监，糖基改變了蛋白質(zhì)斯托克斯半徑水孩，遷移速率往往有較大的減慢，如下圖：
Shaw M L, Stone K L, Colangelo C M, et al. Cellular proteins in influenza virus particles[J]. PLoS pathogens, 2008, 4(6): e1000085.
圖中l(wèi)ane1 為未經(jīng)處理的蛋白琐驴，lane2為去糖基化的蛋白俘种，糖基化蛋白質(zhì)的表觀分子量顯著高于實(shí)際，而去糖基化處理后基本上恢復(fù)正常绝淡。組氨酸標(biāo)簽融合常用于蛋白質(zhì)的分離純化宙刘，細(xì)心的技術(shù)人員可能會(huì)發(fā)現(xiàn)，末端融合組氨酸標(biāo)簽后牢酵，表觀分子量往往會(huì)變大悬包，這主要是正電荷增加導(dǎo)致的。組氨酸融合蛋白質(zhì)不同于組蛋白馍乙，末端的組氨酸一般不會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)布近，但末端氨基酸殘基對(duì)等電點(diǎn)卻有很大影響，分析一些等電點(diǎn)計(jì)算軟件的開源代碼丝格，不難發(fā)現(xiàn)撑瞧，蛋白質(zhì)兩端氨基酸在計(jì)算等電點(diǎn)時(shí)有更高的權(quán)重。
??除了上面羅列的這些情況显蝌，一些金屬離子依賴的酶预伺，在SDS存在時(shí)仍有結(jié)合金屬離子的能力，如鈣調(diào)蛋白質(zhì)曼尊，有沒有Ca2+離子扭屁，表觀分子量差異極大。因此涩禀，在進(jìn)行蛋白質(zhì)分析時(shí)，如果需要比較準(zhǔn)確的分析蛋白質(zhì)分子量最好選擇質(zhì)譜然眼；要鑒定蛋白時(shí)艾船，如果是酶最直接的方法的是活性鑒定，如果是其他蛋白質(zhì)（抗原、抗體屿岂、細(xì)胞因子等）可以選擇western blot践宴，IP等免疫學(xué)方法，SDS-PAGE只能作為一種輔助驗(yàn)證方法爷怀，不能作為唯一判斷標(biāo)準(zhǔn)阻肩。 -
經(jīng)過SDS、還原劑运授、高溫處理得到的一定是單亞基嗎烤惊？
Kado Y, Inoue T, Ishikawa K. Structure of hyperthermophilic β-glucosidase from Pyrococcus furiosus[J]. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2011, 67(12): 1473-1479.
??這是Kado等研究強(qiáng)烈火球菌超嗜熱β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE結(jié)果，酶經(jīng)2% SDS吁朦，710 mM β-巰基乙醇柒室，95℃處理20min，蛋白質(zhì)依然以二聚體形態(tài)出現(xiàn)逗宜。在常規(guī)的還原型SDS-PAGE中雄右，SDS主要破環(huán)氫鍵和疏水作用，β-巰基乙醇還原二硫鍵纺讲，高溫破環(huán)三維結(jié)構(gòu)也使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合擂仍，但這并不是必然的。一些多聚體蛋白質(zhì)熬甚，有極強(qiáng)的分子間相互作用（氫鍵逢渔、鹽橋、疏水作用）则涯，SDS复局、還原劑、高溫處理并不能完全破壞這種作用粟判，無法得到單亞基亿昏，所以有時(shí)看到電泳結(jié)果上出現(xiàn)倍數(shù)關(guān)系的條帶，可能是蛋白質(zhì)亞基未完全解離所致档礁。對(duì)亞基間邊界作用分析感興趣的可以參考《體外分子進(jìn)化改善β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性》一文中第六章的內(nèi)容角钩。
