前言——主要內(nèi)容
這篇筆記是StatQuest系列筆記的第58節(jié)念秧，主要內(nèi)容是講RNA-seq的原理噪矛。StatQuest系列教程的58到62節(jié)是協(xié)錄組測(cè)序的內(nèi)容。
RNA-seq研究的是什么
我們先來(lái)看一個(gè)案例雀瓢，在下面的這個(gè)案例中圆存，藍(lán)色的細(xì)胞是一群正常的神經(jīng)細(xì)胞，紅色的細(xì)胞是一群突變的神經(jīng)細(xì)胞伴挚。其中靶衍，突變的神經(jīng)細(xì)胞表型與正常的神經(jīng)細(xì)胞表型不同，此時(shí)茎芋，我們想知道摊灭，是什么遺傳機(jī)制導(dǎo)致了這兩群細(xì)胞表型的差異，這就意味著败徊，我們要研究一下這兩種細(xì)胞基因表達(dá)的差異帚呼，如下所示：
接下來(lái)，我們就來(lái)看一下皱蹦，怎么找出這兩群細(xì)胞基因表達(dá)的差異煤杀。
首先，根據(jù)高中的生物知識(shí)我就知道沪哺，一個(gè)細(xì)胞都有一群染色體（其數(shù)目因物種的不同而異）沈自，每條染色體上都有一些基因，在這些基因中辜妓，有些基因處于活躍狀態(tài)枯途，在下圖中忌怎，這些活躍基因上面的波形圖案表示這些基因mRNA的轉(zhuǎn)錄本，如下所示：
但是酪夷，還有一些基因是不活躍的榴啸，如下所示：
而高通量測(cè)序技術(shù)就能告訴我們，哪些基因是活躍的晚岭，以及它們的轉(zhuǎn)錄水平是多少鸥印，如下所示：
那么我們就可以通過(guò)RNA-Seq技術(shù)檢測(cè)一下正常細(xì)胞的基因表達(dá)，再檢測(cè)一下突變細(xì)胞的基因表達(dá)坦报，如下所示：
然后我們比較一下這兩種細(xì)胞基因表達(dá)的差異库说，如下所示：
例如，在這個(gè)案例中片择，我們就可以發(fā)現(xiàn)潜的，經(jīng)過(guò)RNA-Seq檢測(cè)后，基因1的轉(zhuǎn)錄水平在這兩種細(xì)胞內(nèi)是沒(méi)有差異的字管，如下所示：
但是啰挪，基因2的轉(zhuǎn)錄則有很大的差異，如下所示：
基因3的轉(zhuǎn)錄水平也有差異纤掸，如下所示：
RNA-Seq的步驟
RNA-Seq主要有三個(gè)步驟，分別是第一：建庫(kù)浑塞；第二借跪，測(cè)序；第三酌壕，數(shù)據(jù)分析掏愁，如下所示：
第一步：建庫(kù)
在這一步，我們就以Illumina的實(shí)驗(yàn)流程和測(cè)序儀為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行講解卵牍，其他公司的流程和測(cè)序儀可能略有出入果港，如下所示：
建庫(kù)又分這些步驟：
第一步，提取RNA糊昙；
第二步辛掠，將RNA打斷成小的片段，打斷的目的主要是因?yàn)镽NA的長(zhǎng)度有幾千個(gè)堿基释牺，而測(cè)序儀的讀長(zhǎng)只有200到300個(gè)bp萝衩，因此要進(jìn)行打斷，如下所示：
第三步没咙，將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA猩谊，這一步的目的在于，雙鏈DNA比RNA更加穩(wěn)定祭刚，雙鏈DNA更容易擴(kuò)增與修飾牌捷，如下所示：
第四步墙牌，添加接頭。接頭主要發(fā)揮兩個(gè)作用暗甥，第一喜滨，使測(cè)序儀識(shí)別加了接頭的片段，因?yàn)榻宇^上的序列與測(cè)序儀芯片上序列互補(bǔ)淋袖；第二鸿市，添加接頭可以在一次測(cè)序中區(qū)分不同的樣本，因?yàn)椴煌臉颖究梢允褂貌煌慕宇^即碗，如下所示：
但我們需要注意的是焰情，在加接頭這個(gè)步驟中，它的效率并不是100%的剥懒，有些片段并不會(huì)被加上接頭内舟，如下所示：
第五步：PCR擴(kuò)增，這一步的擴(kuò)增引物是接頭上序列初橘，只有那些加上了接頭的序列才能擴(kuò)增验游，如下所示：
第六步：質(zhì)控。這一步主要是看兩個(gè)指標(biāo)：第一保檐，確定文庫(kù)的濃度耕蝉，第二，確定文庫(kù)的長(zhǎng)度夜只。確定文庫(kù)的濃度方法就是（根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室自己的流程）垒在，用Qubit檢測(cè)一下文庫(kù)的濃度，這個(gè)濃度比較粗略扔亥，不能當(dāng)成精確的數(shù)值场躯，接著，使用qPCR的方法旅挤，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行絕對(duì)定量踢关，經(jīng)過(guò)qPCR絕對(duì)定量方法得到的文庫(kù)濃度才是最終的文庫(kù)濃度。在確定文庫(kù)片段的長(zhǎng)度方面粘茄，通常是使用Agilent 2100進(jìn)行檢測(cè)签舞，如下所示：
第二步：測(cè)序
測(cè)序測(cè)的其實(shí)就是文庫(kù)，我們假設(shè)DNA片段的序列是下圖的左側(cè)部分柒瓣，它是垂直的瘪菌，因?yàn)樵跍y(cè)序儀的芯片上，文庫(kù)就是垂直排列的嘹朗，在測(cè)序芯片上的一個(gè)小方格（grid）中將近有4億條這樣的序列师妙，為了方便講解，我們?cè)谙聢D的右側(cè)只列出4條這樣的序列屹培，這樣的一個(gè)小方格被稱(chēng)為flowcell默穴，如下所示：
下圖是一個(gè)flowcell：
在測(cè)序儀所使用的測(cè)序試劑中怔檩，含有一些特殊的堿基，這些堿基帶有熒光探針蓄诽，這些熒光探針按其結(jié)合堿基的不同薛训，其顏色也不同，當(dāng)測(cè)序儀開(kāi)始測(cè)序時(shí)仑氛，這些帶有熒光探針的堿基就會(huì)結(jié)合到DNA片段上第1個(gè)堿基乙埃，如下所示：
一旦這些帶有熒光探針的堿基結(jié)合到DNA片段的堿基上，此時(shí)測(cè)序儀就會(huì)拍下一張照片锯岖，如果從上往下看介袜，就是下圖中紅框所示的圖片，這張圖片會(huì)告訴測(cè)序儀出吹，左下角的堿基是A遇伞，如下所示：
右下角的堿基就是G，如下所示：
左上角與右上角的堿基就是C捶牢，如下所示：
拍照結(jié)束后鸠珠，測(cè)序儀會(huì)把這些這些堿基上的探針給沖走（測(cè)序試劑中有其他的成分，可以切掉這些熒光探針）秋麸，此時(shí)渐排，這些攜帶有探針的堿基就成了普通堿基，如下所示：
然后再加入含有熒光探針的堿基灸蟆，再次與片段結(jié)合驯耻，如下所示：
在第二次結(jié)合后，測(cè)序儀會(huì)拍照次乓，從上往下看吓歇，就是下圖紅框內(nèi)的圖片孽水，如下所示：
這樣測(cè)序儀就知道票腰，左下角的堿基是C，如下所示：
右下角的堿基是G女气，如下所示：
左上與右上的堿基是T杏慰，如下所示：
第2張圖片識(shí)別后，再次用試劑切掉這些堿基上的熒光探針炼鞠，并沖走缘滥，如下所示：
再進(jìn)行第3次反應(yīng)，如下所示：
總之谒主，測(cè)序儀會(huì)不斷地循環(huán)這個(gè)過(guò)程朝扼，直到測(cè)完所有的堿基，如下所示：
不過(guò)在實(shí)際的測(cè)序過(guò)程霎肯，這些DNA鏈的密度非常大擎颖，構(gòu)成了一個(gè)密度極高的顏色矩陣榛斯，這個(gè)過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生一些問(wèn)題，在下面我們就用一個(gè)簡(jiǎn)單的矩陣來(lái)說(shuō)明這個(gè)問(wèn)題搂捧，如下所示：
有時(shí)候驮俗，一個(gè)熒光探針的亮度可能不夠，此時(shí)測(cè)序儀就沒(méi)有足夠的把握能夠識(shí)別這種顏色允跑，而在測(cè)序的過(guò)程中王凑，根據(jù)這些探針的亮度，會(huì)生成一個(gè)質(zhì)量評(píng)分（Quality score）聋丝，這個(gè)質(zhì)量評(píng)分反映了測(cè)序儀對(duì)這個(gè)顏色識(shí)別的可信程度索烹，像在下面的這個(gè)圖片中，這個(gè)比較暗的點(diǎn)可能就會(huì)得到一個(gè)比較低的質(zhì)量評(píng)分潮针，如下所示：
還有另外一種情況可能會(huì)得到一個(gè)質(zhì)量評(píng)分术荤，就是在某個(gè)區(qū)域內(nèi)，相同的堿基數(shù)目太多每篷，都呈現(xiàn)出一種顏色瓣戚，如下圖綠框所示部分，這種現(xiàn)象稱(chēng)為多樣性差（low diversity）焦读，這種情況下子库，由于存在著大量的單一熒光，測(cè)序儀很難識(shí)別單獨(dú)的堿基矗晃，這些顏色會(huì)混到一起仑嗅。當(dāng)測(cè)序儀測(cè)序時(shí)，對(duì)于文庫(kù)中前幾個(gè)堿基的識(shí)別很容易出現(xiàn)多樣性差的問(wèn)題张症，這是因?yàn)樵趧傞_(kāi)始的時(shí)候仓技，測(cè)序儀要識(shí)別DNA片段位于芯片上的位置時(shí)，如下所示：
我們看一下測(cè)序后的原始數(shù)據(jù)俗他，下圖是測(cè)序的一個(gè)read的信息脖捻，它由4行構(gòu)成，如下所示
第1行通常是由@開(kāi)頭的兆衅，它對(duì)于每條read地沮，它都有唯一的ID，如下所示羡亩；
第2行是測(cè)序的文庫(kù)片段的堿基序列摩疑，如下所示：
第3行是一個(gè)加號(hào)，它通常是空的畏铆，如下所示：
第4行是質(zhì)量信息雷袋，它用一個(gè)字符表示這個(gè)字符對(duì)應(yīng)的堿基的質(zhì)量評(píng)分，如下所示：
一次測(cè)序通常有4億條reads數(shù)辞居，一共會(huì)產(chǎn)生16億行信息楷怒，如下所示：
數(shù)據(jù)預(yù)處理
我們現(xiàn)在已經(jīng)知道了原始數(shù)據(jù)寨腔，以及原始數(shù)據(jù)如何產(chǎn)生的，那么我們下面要做這三件事情：
第一率寡， 過(guò)濾掉垃圾reads迫卢；
第二，將高質(zhì)量的reads比對(duì)到基因組上冶共；
第三乾蛤，對(duì)每個(gè)基因的reads數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如下所示：
過(guò)濾垃圾reads
垃圾reads是指：第一捅僵，某些reads的堿基質(zhì)量低家卖；第二，這些reads是明顯的結(jié)合錯(cuò)誤（第二種低質(zhì)量的reads我不太清楚庙楚，原文我也看不太懂上荡，我個(gè)人理解就是兩個(gè)接頭直接連接在一起的read）。
一條典型的read是一個(gè)DNA片段加上兩個(gè)接頭馒闷，但是在某些情況下酪捡，兩個(gè)接頭會(huì)直接加在一起，這就是垃圾reads纳账，如下所示：
將read比對(duì)到基因組
我們先看一下基因組上的堿基序列逛薇，由于基因組的堿基序列很長(zhǎng)，我們只截取一段出來(lái)疏虫，如下圖中的紅框所示永罚，把這條基因組的堿基打斷，會(huì)生成這些短的堿基序列卧秘，如下所示：
此時(shí)呢袱，我們把基因組的這些片段加上索引，并記錄下它們?cè)谌旧w上的位置翅敌，就是下圖藍(lán)框中的部分羞福，如下所示：
此時(shí)，我們把我們的測(cè)序read也打成小片段哼御，就像上面的基因組打成小片段一樣坯临，如下所示：
然后把reads的小片段與基因組的小片段進(jìn)行匹配焊唬，如下所示：
那些與reads的小片段匹配的基因組小片段就是這些read小片段在基因組上的位置（哪條染色體上祷肯，染色體的哪個(gè)位置）辜羊，如下所示：
此時(shí)，我們可能有一個(gè)問(wèn)題，為什么要把這些序列打斷成小片段啥繁，這是因?yàn)榧词箁eads與參考基因組在不是特別精確匹配的情況下，也能進(jìn)行匹配，如下所示：
我們來(lái)看一個(gè)簡(jiǎn)單的例子，在下圖中谤祖，某條read最左側(cè)是A，而對(duì)應(yīng)的基因組上并沒(méi)有這個(gè)A（打個(gè)很簡(jiǎn)單的案例老速，我自己的基因組肯定與別人的基因組略有差異）粥喜，如下所示：
即使這個(gè)小片段無(wú)法與基因組上相匹配，那么其它的小片段還是能夠匹配的橘券，此時(shí)我們?nèi)匀豢梢哉业竭@條read來(lái)源于基因組的哪個(gè)位置额湘，如下所示：
每個(gè)基因的reads計(jì)數(shù)
一旦我們知道了某條read的位置（也就是說(shuō)知道了這條read在哪條染色體上，以及在染色體的哪個(gè)位置上）旁舰，那么我們就可以看一下這條read是否能夠落在某個(gè)基因的坐標(biāo)中（或者是某些其它感興趣的區(qū)域）锋华，例如在下圖中，我們列出了Xkr4和Rp1這兩個(gè)基因的坐標(biāo)箭窜，如下所示：
當(dāng)我們統(tǒng)計(jì)了每個(gè)基因的reads數(shù)后毯焕，我們就會(huì)得到下面這樣的矩陣，如下所示：
第1列是基因名磺樱，在人類(lèi)中纳猫，人類(lèi)大概有20000個(gè)基因，因此這個(gè)矩陣的大概有2萬(wàn)行（下圖中并沒(méi)列完所有的基因）竹捉，如下所示：
剩余的幾列是每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的基因的reads數(shù)续担，這里的樣本數(shù)目大概是6到800個(gè)，如下所示：
對(duì)于大部分的RNA-Seq來(lái)說(shuō)活孩，一個(gè)“樣本”通常是一群細(xì)胞的平均值（通常是600萬(wàn)個(gè)細(xì)胞）物遇，一次實(shí)驗(yàn)，一般有3個(gè)正常的樣本憾儒，3個(gè)疾病狀態(tài)的樣本询兴，總共就是6個(gè)樣本，如下所示：
而對(duì)于單細(xì)胞測(cè)序（Single-cell RNA-Seq）來(lái)說(shuō)起趾，每個(gè)細(xì)胞就是一個(gè)樣本诗舰，因此這個(gè)矩陣中會(huì)出現(xiàn)有幾百個(gè)樣本，例如800多個(gè)训裆，如下所示：
我們現(xiàn)在看某一行數(shù)據(jù)眶根，如下所示，在這行數(shù)據(jù)中边琉，我們可以看到每個(gè)樣本中属百，每個(gè)特定基因的reads數(shù)，如下所示：
如果這個(gè)矩陣是單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)变姨，那么這個(gè)矩陣有2萬(wàn)行（基因數(shù)目）族扰，800多列（樣本數(shù)），大概有1600萬(wàn)個(gè)數(shù)值，這是一個(gè)極大的矩陣渔呵，并且隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展怒竿，所測(cè)樣本數(shù)目的增多，這樣的矩陣會(huì)越來(lái)越大扩氢，如下所示：
在進(jìn)行最終的數(shù)據(jù)分析之前耕驰，我們還要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化，這是因?yàn)槊總€(gè)樣本比對(duì)到基因組上的reads數(shù)都不同录豺，這可能是由于在測(cè)序時(shí)耍属，有些樣本的reads質(zhì)量低，而另外某些樣本的濃度略大巩检，導(dǎo)致其總的reads數(shù)略高厚骗，如下所示：
例如，在下圖中兢哭，Sample 1有635個(gè)reads比對(duì)上了领舰，而Sample 2則有1270個(gè)reads數(shù)比對(duì)上了，Sample 2是Sample 1的兩倍迟螺。但是這無(wú)法說(shuō)明冲秽，Sample 2轉(zhuǎn)錄的基因是Sample 1的2倍，相反矩父，這只能說(shuō)明锉桑，Sample 2中的低質(zhì)量reads數(shù)少，它在測(cè)序時(shí)窍株，被測(cè)序儀識(shí)別的熒光更多而已民轴，如下所示：
但是，我們發(fā)現(xiàn)球订，Sample 2中基因的reads數(shù)貌似是Sample 1中的基因reads數(shù)的2倍后裸，如下所示：
A2M基因也是如此，如下所示：
因此冒滩，我們需要調(diào)整每個(gè)基因的reads數(shù)微驶，從這樣才能真正反映出不同樣本中比對(duì)上的reads數(shù)之間的差異，如下所示：
均一化最簡(jiǎn)單的方法就是在每個(gè)樣本中开睡，每個(gè)基因的reads數(shù)除以總的比對(duì)上的reads數(shù)因苹，不過(guò)，還有其他更復(fù)雜的方法篇恒，如下所示：
我們?cè)倩氐阶畛醯恼＜?xì)胞與突變細(xì)胞的比較扶檐，我們先有了這兩群細(xì)胞，如下所示：
然后提取RNA婚度，如下所示：
隨后蘸秘，進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)蝗茁，統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因的reads數(shù)醋虏，然后均一化，如下所示：
此時(shí)哮翘，開(kāi)始數(shù)據(jù)處理颈嚼。
第三步：數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)處理的第一步通常都是相同，那就是繪圖饭寺，我們要記住阻课，這個(gè)表達(dá)矩陣非常大，如下所示：
如果每個(gè)樣本只有2基因艰匙，那么繪圖非常簡(jiǎn)單限煞，如下所示：
第1步：繪圖
首先我們用XY來(lái)替代這兩個(gè)基因，根據(jù)它們的表達(dá)水平來(lái)繪圖员凝，如下所示：
但是署驻，我們有2萬(wàn)個(gè)基因，如下所示：
因此我們會(huì)用PCA或者是類(lèi)似的方法來(lái)繪圖健霹，PCA能夠降低坐標(biāo)軸的數(shù)目（也就是把2萬(wàn)個(gè)基因?qū)?yīng)的2萬(wàn)個(gè)坐標(biāo)軸給降低到3個(gè)或2個(gè)）旺上，從而更加直觀地表現(xiàn)數(shù)據(jù)，如下所示：
下圖是我們利用PCA繪制的圖形糖埋，正常的細(xì)胞是wt宣吱，突變的 細(xì)胞是ko，其中正常的細(xì)胞集中在左下角瞳别，敲除的細(xì)胞集中在右下方征候，如下所示：
從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，這兩類(lèi)數(shù)據(jù)的差異主要體現(xiàn)在x軸上祟敛，如下所示：
相反倍奢，Y軸的差異沒(méi)那么大垒棋，如下所示：
這就說(shuō)明卒煞，wt組與ko組的差異主要集中于X軸，如下所示：
但是叼架，當(dāng)我們進(jìn)行下一步的分析時(shí)畔裕，就需要排除wt2這個(gè)樣本了，如下所示：
下圖是單細(xì)胞測(cè)序的PCA圖乖订，如下所示：
上面的不同顏色繪圖依據(jù)是這些細(xì)胞行為的不同扮饶，綠色表示的是靜止的細(xì)胞，橘黃色表示的是遷移到培養(yǎng)皿周?chē)募?xì)胞乍构，如下所示：
大多數(shù)橘黃色的細(xì)胞與綠色的細(xì)胞是不同的甜无，但是在左側(cè)綠色的細(xì)胞中，也有幾個(gè)是橘黃色的細(xì)胞，這說(shuō)明這幾個(gè)細(xì)胞的表型與綠色細(xì)胞更接近岂丘，如下所示：
如果我們想要研究上面兩個(gè)大群細(xì)胞的差異陵究，那么此時(shí)我們就要排除左下那幾個(gè)橘黃色的細(xì)胞，如下所示：
總之奥帘，在對(duì)數(shù)據(jù)繪圖后铜邮，我們可以從中得到這些信息：
- 找到感興趣的差異部分；
- 在進(jìn)行下游的分析之前寨蹋，應(yīng)該排除哪些數(shù)據(jù)松蒜，如下所示：
第2步：尋找差異基因
繪圖后，我們就需要找到正常樣本與突變樣本有哪些差異表達(dá)基因已旧，在分析差異基因時(shí)秸苗，通常使用R中的edgeR或DESeq2，它們通常以下圖進(jìn)行展示运褪，如下所示：
其中紅色部分是正常樣本與突變樣本的差異基因难述，如下所示：
中間的黑色部分是沒(méi)有差異的基因，如下所示：
其中X軸表示的是基因的轉(zhuǎn)錄水平吐句，它的單位是logCPM胁后，其中CPM是counts per million的縮寫(xiě)，如下所示：
Y軸則是表示在正常樣本與突變樣本之間嗦枢，差異基因的差異程度有多大攀芯，單位是logFC，即log(fold change)文虏，如下所示：
此時(shí)我們已經(jīng)找到了感興趣的基因（也就是差異基因）侣诺，此時(shí)我們要做哪些事情呢？
第一氧秘，如果你知道你找的是什么（我的理解就是找的是具體的哪個(gè)基因）年鸳，那么就要做實(shí)驗(yàn)，看能否驗(yàn)證你的假設(shè)丸相；
第二搔确，如果你不知道你接下來(lái)做什么，那么就你可以看一下這些差異基因集能否在某些通路上富集灭忠，如下所示：
每個(gè)樣本對(duì)于每個(gè)特定的基因膳算，它的reads數(shù)都不同。
