前言
這是StatQuest系列視頻教程筆記的最后一篇姐浮，我在YouTube上看了一下珠增，作者還有其他的幾個視頻超歌，有興趣的同學(xué)還可以看看。這篇筆記是視頻教程的第62節(jié)蒂教，主要內(nèi)容是講RNA-Seq中的技術(shù)重復(fù)問題巍举。
是否需要技術(shù)重復(fù)
前面有一篇筆記我們提到了技術(shù)重復(fù)與生物重復(fù)。但在RNA-Seq中凝垛，我們是否需要做技術(shù)重復(fù)呢懊悯？
答案是否，如果你做了生物學(xué)重復(fù)梦皮，就不需要做技術(shù)重復(fù)炭分。或許有同學(xué)知道這個答案剑肯，但是卻不清楚為什么做了生物學(xué)重復(fù)后捧毛，就不需要做技術(shù)重復(fù)了呢，后面我們就會回答這個問題让网，如下所示：
RNA-Seq變異的兩個來源
RNA-Seq的測序數(shù)據(jù)的變異（variation）主要來源兩個方面呀忧，第一個是生物學(xué)變異（Biological Variation），第二個是技術(shù)變異（technical variation）溃睹。
生物學(xué)變異
生物學(xué)變異是指生物本身本身造成的變異而账，例如，即使是遺傳背景完全一樣的小鼠丸凭，例如像C57BL/6N這樣遺傳背景都非常清楚的小鼠福扬，也不存在RNA轉(zhuǎn)錄本數(shù)目完全相同的兩只小鼠（只能是接近腕铸，而不是完全相同）。
任何物種的兩個生物個體都不可能完全一樣铛碑，無論這種生物是人狠裹，小鼠，還是果蠅汽烦。
技術(shù)變異
每當我們做一個實驗時涛菠，在實驗過程中都會參雜一些零碎的非實驗因素（例如今天你的心情，不同批次的培養(yǎng)基撇吞，移液槍的吹打次數(shù)俗冻，細胞培養(yǎng)的時間，細胞的傳代次數(shù)等等）牍颈，其中的一些是完全100%的隨機因素迄薄。因此，當我們再次重復(fù)這個實驗的時煮岁，即使實驗條件與上一次的實驗條件完全相同讥蔽，也不可能得到與上次實驗100%相同的結(jié)果（當然，總體的結(jié)果會相差不大画机，會很接近）冶伞，如下所示：
生物學(xué)變異的案例
為了說明這生物學(xué)變異和技術(shù)變異的問題，我們先來看一個簡單的案例步氏。
在這個案例中响禽，我們只研究生物學(xué)變異。例如荚醒，我們對幾只小鼠做了RNA-Seq芋类，沒有做任何技術(shù)重復(fù)。在下面的二維坐標系中腌且，X軸是小鼠的編號梗肝，Y軸是小鼠基因X的reads數(shù)，下圖是第1只小鼠的數(shù)據(jù)铺董，如下所示：
我們再看一下第2只小鼠的數(shù)據(jù)巫击，如下所示：
由于我們沒有做技術(shù)重復(fù)，因此從上圖中精续，我們可以知道坝锰，第2只小鼠與第1只小鼠的基因X的reads數(shù)差異就是完全來源于生物學(xué)變異了，也就是這兩只小鼠自身的變異重付，現(xiàn)在看第其它小鼠的數(shù)據(jù)顷级，如下所示：
假設(shè)我們把地球上的所有小鼠都給測了，也就是說上圖的X軸上有無數(shù)個小鼠的基因X的reads數(shù)确垫，此時弓颈，我們求出這所有小鼠基因X的reads數(shù)的平均值猾封，并用希臘字母μ表示剑鞍，這個μ就是小鼠基因X的reads數(shù)真正的均值凡蚜，就是下面的這個樣子：
現(xiàn)在我們計算出每只小鼠基因X的reads數(shù)與真實均值μ的差值瓦阐，先看第1只小鼠，它與均值μ的差值是5纤子，如下所示：
現(xiàn)在再計算出剩下的所有小鼠的基因X的reads數(shù)與reads數(shù)平均值的差值搬瑰，為了方便說明問題，這里我們只計算前5只小鼠的數(shù)據(jù)控硼，如下所示：
此時泽论，我們使用數(shù)學(xué)公式來表示這前5只小鼠的基因X的reads數(shù)，這個公式很簡單卡乾，如下所示：
現(xiàn)在我們計算出這5只小鼠的基因X的reads數(shù)的均值翼悴，如下所示：
把上面的公式再整理一下，應(yīng)時下面的這個樣子幔妨，如下所示：
其中上圖公式右側(cè)紅圏的部分是幾個常數(shù)抄瓦，也就是每只小鼠基因X的reads數(shù)與均值μ的差值的均值，并且這個紅圏中的計算結(jié)果（5-1+4+2-5=1）會隨著小鼠樣本數(shù)目的增多而縮小陶冷，從而最終近于0，那么上面的均值最終會等于實際的均值μ了毯辅，如下所示：
考慮生物學(xué)變異與技術(shù)變異的情況
還以上述的案例來說明一下生物學(xué)變異和技術(shù)變異埂伦，為了清楚地說明這兩個變異，在下圖中思恐，我們使用橘黃色的線段來表示生物學(xué)變異沾谜，如下所示：
我們使用綠色的箭頭來表示技術(shù)變異，其中綠色箭頭向下表示技術(shù)重復(fù)導(dǎo)致的reads數(shù)降低胀莹，綠色箭頭向上表示reads數(shù)上升的情況基跑，如下所示：
現(xiàn)在我們考慮生物學(xué)變異和技術(shù)變異的情況下，來計算一下前5只小鼠的基因X的reads數(shù)均值描焰，如下所示：
現(xiàn)在整理一下上面的均值公式媳否，我們可以發(fā)現(xiàn)，這個公式可以公為3部分荆秦，第1部分是均值μ篱竭，第2部分是生物學(xué)變異，第3部分是技術(shù)變異步绸，如果我們增加樣本的話掺逼，那么這兩個變異就會接近于0，因為它們的分子中既有正值瓤介，又有負值吕喘，因此最終會相互抵消赘那，因此，做了生物學(xué)重復(fù)（一共有5只小鼠）的這批小鼠的最終基因X的reads均值就是μ氯质，如下所示：
只做技術(shù)重復(fù)的情況
我們現(xiàn)在考慮另外一種情況募舟，即我們只做了技術(shù)重復(fù)。例如針對第1只小鼠病梢，我們做了5次技術(shù)重復(fù)胃珍，它的基因X的reads數(shù)如下所示：
其中生物學(xué)變異使用橘黃色表示，橘黃色線段的大小都一樣蜓陌，這是因為對同一只小鼠做了5次技術(shù)重復(fù)觅彰，同一只小鼠的生物學(xué)變異是一樣的，另外钮热，在下圖中我們再添加上技術(shù)變異填抬，技術(shù)變異使用綠色表示，如下所示：
現(xiàn)在我們計算一下第1只小鼠的基因X的reads數(shù)均值隧期，如下所示：
其中我們可以發(fā)現(xiàn)飒责，在這個案例中，第1只小鼠的基因X的reads數(shù)的均值由3部分構(gòu)成仆潮。
第1部分是實際均值μ宏蛉，第2部分是生物學(xué)變異，它是一個固定的值性置，因為對于一只確定的小鼠來說拾并，它的生物學(xué)變異是確定的，因此針對這只確定的小鼠來說鹏浅，無論做多少次技術(shù)重復(fù)嗅义，它的生物學(xué)變異都是一個固定值，不會相互抵消隐砸，在這里之碗，這個值是5。第3部分是技術(shù)變異季希，不過由于技術(shù)變異的分子部分有正數(shù)褪那，有負數(shù)，因此隨著技術(shù)重復(fù)的增多式塌，技術(shù)變異的分子會相互抵消武通，最終接近于0，因此第1只小鼠基因X的reads數(shù)的均值最終結(jié)果是μ+5珊搀。
比較生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)
生物學(xué)重復(fù)
現(xiàn)在我們比較一下生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)冶忱，回到我們前面的部分，我們知道境析，基因X的reads數(shù)的平均值公式是由3三部分構(gòu)成的囚枪，其中第1部分是真實的均值μ派诬，第2部分是生物學(xué)重復(fù)，用橘黃色表示链沼，第3部分是技術(shù)重復(fù)默赂，用綠色表示，如下所示：
第1部分是真實的均值μ括勺，這里再強調(diào)一下缆八，真實的均值可以理解為所有小鼠基因X的reads數(shù)的均值，而我們平時所測的小鼠基因X的reads數(shù)是對這個均值μ的估計值疾捍，因為我們不可能把所有的小鼠基因X都給測了奈辰，估計值只能無限接近于真實均值μ，但法等于均值乱豆，不過當樣本量足夠大時奖恰，此時的估計值就可以視為均值μ。
公式的第2部分是生物學(xué)變異宛裕，第3部分是技術(shù)變異瑟啃。由于生物學(xué)變異和技術(shù)變異的分子部分都是有正值，負值揩尸，因此第2部分與第3部分最終會抵消蛹屿，得到的結(jié)果就會非常接近于真正的均值μ，它就代表了所有的小鼠基因X的reads數(shù)岩榆，如下所示：
無生物學(xué)重復(fù)
現(xiàn)在我們再看一下無生物學(xué)重復(fù)蜡峰，有技術(shù)重復(fù)的情況下，我們計算一下第1只小鼠的基因X的reads數(shù)均值朗恳，如下所示：
這個公式由3部分組成，即真實均值μ载绿，生物學(xué)變異和-技術(shù)變異粥诫，如果我們不斷地增加樣本，那么這個均值就成了Average = μ +5崭庸，最終這個結(jié)果只能提供第1只小鼠的信息怀浆，而非其它所有小鼠的信息，也就是說怕享，此時的這個μ+5只是第1只小鼠基因X的reads數(shù)均值执赡，而不是真實的均值μ，它不能代表整個小鼠的基因X的reads數(shù)函筋，如下所示：
結(jié)論就是沙合，如果我們只對這個小鼠做多次技術(shù)重復(fù)，最終得到的數(shù)據(jù)就是這個小鼠的數(shù)據(jù)跌帐，不具有代表性首懈，也就是說绊率，如果別人的實驗室重復(fù)這個實驗的話，有可能重復(fù)不出來究履。
同時做生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)
此時我們可能會想滤否，如果我既做了生物學(xué)重復(fù)，又做了技術(shù)重復(fù)最仑，那么是不是能得到最精確的結(jié)果藐俺？
很不幸，答案是否定的泥彤。在下面的這個案例中欲芹，我們對第1只小鼠做了2個技術(shù)重復(fù)，第2只小鼠做了3個技術(shù)重復(fù)全景，如下所示：
那么我們求出均值耀石，如下所示：
如果我們不再做另外的生物學(xué)重復(fù)，那么上述公式的第2部分（也就是橘黃色的生物學(xué)變異部分）就不會相互抵消爸黄，最終接近于0滞伟，如下所示：
但是，如果做了更多的生物學(xué)重復(fù)炕贵，那么它會接近于0梆奈，不過需要的生物學(xué)重復(fù)數(shù)量會更多，因為如果生物學(xué)重復(fù)的數(shù)量量不是特別多的話称开，這第2部分就不會很快地接近0亩钟，如下所示：
我們就看一下，將中間這一項相互抵消為0需要多少個生物學(xué)重復(fù)鳖轰。我們對第2只小鼠做了3次技術(shù)重復(fù)清酥，這3次技術(shù)重復(fù)中，每個技術(shù)重復(fù)的生物學(xué)變異是相同的蕴侣，例如第2只小鼠的生物學(xué)變異是-1焰轻，那么第2只小鼠做了3次技術(shù)重復(fù)，這3次技術(shù)重復(fù)的變異分別為2昆雀，-2辱志，-1（圖中數(shù)據(jù)），由于是同一只小鼠狞膘，那么這3次技術(shù)變異對應(yīng)的生物學(xué)變異是一樣的揩懒，分別是-1，-1挽封，-1（還是圖中數(shù)據(jù)）已球。
因此，為了降低這種生物學(xué)變異的程度，至少也是降低到與前面測了5只小鼠（第1只小鼠到第5只小鼠）同等的水平和悦，那么我們一共需要做15次退疫，這15次就是：5個生物學(xué)重復(fù)，1個生物學(xué)重復(fù)做3次技術(shù)重復(fù)鸽素，一共是15次褒繁。用公式表示就是下圖中的最后一行，如下所示：
現(xiàn)在我們比較一下這三種實驗（分別是①只做生物學(xué)重復(fù)馍忽；②既做生物學(xué)重復(fù)棒坏，又做技術(shù)重復(fù)；③只做技術(shù)重復(fù)）的情況：
從上述的結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)這些規(guī)律：
- 只做生物學(xué)生重復(fù)的結(jié)果最接近于均值μ遭笋，這是最好的結(jié)果坝冕；
- 既做了生物學(xué)重復(fù)，又做了技術(shù)重復(fù)的話瓦呼，它要么接近于均值μ（這個需要做更多的生物學(xué)重復(fù)喂窟，生物學(xué)重復(fù)與技術(shù)重復(fù)加起來要做15次），要么是均值
μ+常數(shù)（只做更多的技術(shù)重復(fù)央串，不做更多的生物學(xué)重復(fù)）磨澡； - 最差的結(jié)果就是不做生物學(xué)重復(fù)，只做技術(shù)重復(fù)质和，如下所示：
結(jié)論就是稳摄，只做生物學(xué)重復(fù)就行了，就像上面的第1種情況饲宿，此時厦酬，我們只需要測序5次即可，如果既做生物學(xué)重復(fù)瘫想，又做技術(shù)重復(fù)仗阅，那么我們就需要測序15次，相當于成本直接上升到原來的3倍国夜。
