希望可以認(rèn)識志同道合的學(xué)習(xí)和研究的小伙伴。有一個最近日更的公眾號（疫情期間在家更新很勤，以后開學(xué)了大概2-3天更新一篇學(xué)習(xí)筆記搓扯，文獻閱讀或者其他隨筆苹丸，分子生物學(xué)愤惰，病毒學(xué)方向）——番茄隨筆（二維碼在個人主頁），歡迎關(guān)注赘理，歡迎留言宦言，我們一起討論問題呀。
一商模、前言：
分子生物學(xué)著重于分子機制的研究奠旺，即基因與基因組的結(jié)構(gòu)和功能，生物大分子執(zhí)行功能的過程施流。這個領(lǐng)域的發(fā)展源于工具和方法的發(fā)展响疚，每一場技術(shù)革命都讓分子生物學(xué)煥發(fā)新生。
時間久遠的書和文獻里面的發(fā)現(xiàn)瞪醋，現(xiàn)在大多被當(dāng)成了技術(shù)在應(yīng)用忿晕，每每看到都讓我感慨科學(xué)的成長和活力；也慚愧自己站在巨人的肩膀上银受，卻只是數(shù)著腳下的沙礫践盼，并沒能遠眺前方鸦采。
從第一次猜想DNA結(jié)構(gòu)，到第一個限制性內(nèi)切酶和質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)咕幻，再到新技術(shù)用于探測和擴增DNA渔伯。我們穩(wěn)步進入了全基因組時代，甚至后基因組時代谅河，各種組學(xué)層出不窮......
二咱旱、翻翻分子生物學(xué)家的工具箱
1.克隆（clone）：獲得目的基因绷耍。
2.表達（expression）：表達新性狀或者收獲目的蛋白吐限。
3.核酸酶（nuclease）：能夠?qū)⒕酆塑账徭湹牧姿岫ユI切斷的酶，稱為核酸酶褂始。
（1） 核酸外切酶（exonuclease ）：核酸外切酶是一類從多核苷酸鏈的末端開始逐個降解核苷酸的酶诸典。比如exoⅠ，exoⅢ崎苗，exoⅦ狐粱，λexo等。
（2） 核酸內(nèi)切酶（endonuclease）：可水解分子鏈內(nèi)部磷酸二酯鍵生成寡核苷酸的酶胆数，與核酸外切酶相對應(yīng)肌蜻。例如DNaseⅠ，DNaseⅡ必尼，RNase蒋搜、RNaseT1等。前兩個定義拋磚引玉判莉，下面看應(yīng)用最為廣泛的：
（3） 限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）：是可以識別并附著特定的脫氧核苷酸序列豆挽，并對每條鏈中特定部位的兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶，簡稱限制酶券盅，有三種類型帮哈。如Bam H，EcoRⅠ锰镀，EcoRⅡ娘侍，HindⅡ，HindⅢ互站，HpaI私蕾，HpaⅡ，MboI胡桃，MboⅡ等踩叭，細(xì)菌是其主要來源。酶的識別序列，切割位點以及產(chǎn)生的末端都不同容贝。我覺得它是分子試驗中最重要的工具自脯。
（4） 限制性酶切位點分布圖（restriction map）：又叫物理圖譜（physical map）如果我們有一段已知序列，就可以得知它的限制圖斤富，這對于后期的試驗膏潮，如克隆等極其重要（分布圖可以用各種各樣的基因編輯軟件實現(xiàn)，比如DNAstar（沒用過）满力，Geneious（在用）等焕参。我這里再推薦一個簡潔的網(wǎng)站，功能很多且看起來灰常順眼油额，建議收藏http://www.detaibio.com/sms2/）叠纷。
4.載體（vector）：承載裝置，功能如其名潦嘶，承載外源插入序列（insert）到受體細(xì)胞的工具涩嚣，我們常用的載體一般來自于質(zhì)粒和病毒。按照目的分為克隆載體和表達載體
5.轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)（具體定義在本公眾號《【現(xiàn)學(xué)現(xiàn)賣】基因及基本概念》一文中提到）：將目的DNA或者構(gòu)建好的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程掂僵，對于不進行生理轉(zhuǎn)化的大腸桿菌航厚，常用的是CaCl2法和電擊法；還有一些載體本身是具有侵染性的病毒锰蓬，那么通過感染就可將DNA導(dǎo)入寄主幔睬；與之類似的是脂質(zhì)體，它可以與細(xì)胞膜融合從而將內(nèi)含物釋放入細(xì)胞芹扭；不得不提的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法溪窒；還有顯微注射法和基因槍法。這里的分級和分類又有點混亂了冯勉，以后有機會再展開講。
三摹芙、專一化的載體
就像我們的螺絲刀刀頭分為一字灼狰、十字、方頭和六角一樣浮禾，每一種工具為實現(xiàn)不同實驗?zāi)康亩鴮Ｒ换?/p>
載體類別很多交胚，分類標(biāo)準(zhǔn)也是，按照載體本身性質(zhì)分為病毒載體和非病毒載體（質(zhì)粒盈电，粘粒等）等蝴簇；按照功能分為克隆載體和表達載體；按照受體細(xì)胞類型分為原核載體匆帚，真核載體以及兩者均可的穿梭載體熬词。根據(jù)不同的實驗?zāi)康牟捎貌煌妮d體，并配套使用不同的克隆技術(shù)（TA、directing互拾、gateway等等歪今，我發(fā)現(xiàn)實驗這部分內(nèi)容真的是難以置信的多，越寫越多颜矿。）
1. 質(zhì)粒載體
首先想介紹的是我最近在用的這款pGEM?-T Easy克隆載體寄猩，具體實驗操作見Promega官方網(wǎng)站。
（1）載體名字組成：p表示是一種質(zhì)粒（質(zhì)粒的命名：以p開始骑疆，后面用兩個大寫字母表示發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的研究者或者實驗室名稱比如pUC質(zhì)粒田篇，后面的數(shù)字是指這一系列質(zhì)粒的編號），GEM是一個系列載體的名稱（應(yīng)該是對之前存在的載體進行改造后重命名的）箍铭，T是指載體DNA5’端有游離的T（可用于PCR產(chǎn)物的直接克隆泊柬，因為一般PCR產(chǎn)物3’端有A堿基，這樣目的基因與載體粘端互補）坡疼。
（2）物理圖譜：
（3）構(gòu)建之路：調(diào)整質(zhì)粒結(jié)構(gòu)彬呻，提高轉(zhuǎn)化率。通常引入MCS（多克隆位點）柄瑰，或引入具有多種用途的輔助序列闸氮。比如加入lacZ’、lacⅠ基因獲得藍白斑篩選能力教沾；加入SP6聚合酶啟動子獲得體外轉(zhuǎn)錄能力蒲跨；加真核啟動子則變成穿梭載體等等。在實驗時授翻，如果有需要也可以自己構(gòu)建載體或悲。
pBR322（雙抗篩選）+M13mp（lacZ’乳糖操縱子與藍白斑篩選就不展開了）→pUC18/19（藍白篩選）
pUC18/19（藍白篩選）+SP6和T7啟動子（體外轉(zhuǎn)錄）+T堿基（增強連接效率）→pGEM?-T Easy（藍白篩選，體外轉(zhuǎn)錄（其產(chǎn)物可制備體外翻譯的模板堪唐，探針及反義RNA）巡语，酶切位點豐富（為回收克隆片段，進行亞克隆等提供便利淮菠。））
2. 噬菌體載體
λ噬菌體載體
噬菌體：λ噬菌體是大腸桿菌中的病毒男公，λ-DNA是絲狀雙鏈DNA分子，48.5kb合陵，兩端各有一個12個核苷酸的互補單鏈枢赔，是天然的粘末端，稱為cos位點拥知。
載體構(gòu)建：通過對λ-DNA進行長度（48.5kb太大了踏拜，切掉了不必要的序列）和酶切識別位點的修飾（酶切位點是否成對出現(xiàn)決定了載體是插入型還是替換型），僅保留cos位點低剔，左臂的頭尾基因速梗，右臂的裂解基因和需要的酶切位點肮塞，構(gòu)建出了λ噬菌體載體。外源DNA與改造后的λ-DNA重組后镀琉，與噬菌體蛋白進行體外包裝峦嗤，可以形成感染力極強的載體，侵染宿主屋摔。
優(yōu)勢：與質(zhì)粒的相比烁设，λ噬菌體載體裝載外源DNA量大，可以連接25kb的DNA钓试，且侵染力強装黑，即轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。
M13噬菌體載體
噬菌體：M13噬菌體也是大腸桿菌的病毒弓熏，其遺傳物質(zhì)是閉環(huán)正鏈ssDNA恋谭，6.4kb。
載體構(gòu)建：插入標(biāo)記基因lacZ’挽鞠，多克隆位點疚颊，消除多余的酶切位點。如M13mp18載體的構(gòu)建信认。
用途：制備單鏈DNA材义，測序，定向克隆嫁赏。
