影響因子：7.3

研究概述：作為最致命的乳腺癌亞型，三陰性乳腺癌（TNBC）是一種侵襲性極強(qiáng)的內(nèi)分泌惡性腫瘤鼓择，復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率都很高三幻。盡管化療和新輔助免疫療法在改善患者預(yù)后方面取得了進(jìn)展，但許多患者仍會(huì)產(chǎn)生化療耐藥性呐能。TNBC患者出現(xiàn)化療耐藥的可能性各不相同念搬。一種推測(cè)認(rèn)為，它與腫瘤微環(huán)境（TME）密切相關(guān)摆出。與其他亞型相比朗徊，TNBC具有獨(dú)特的TME，為癌細(xì)胞與周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞懊蒸、免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相互作用創(chuàng)造了有利的環(huán)境荣倾，可刺激病情進(jìn)展悯搔。作為T(mén)細(xì)胞的一個(gè)特殊亞群骑丸，T調(diào)節(jié)細(xì)胞（Tregs）可抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，并通過(guò)抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)防止自身免疫妒貌。TME浸潤(rùn)的Tregs可通過(guò)激活免疫抑制和促腫瘤生成信號(hào)來(lái)創(chuàng)造免疫抑制環(huán)境通危，從而減少對(duì)化療和放療反應(yīng)的影響。Tregs在TME中的潛在作用和Treg細(xì)胞的潛在治療靶點(diǎn)可能為T(mén)NBC的腫瘤免疫療法提供新的干預(yù)措施灌曙。本研究利用WGCNA確定了METABRICTNBC樣本中與Treg浸潤(rùn)相關(guān)的模塊菊碟。隨后，根據(jù)與Treg浸潤(rùn)相關(guān)的模塊建立了預(yù)后模型在刺。隨后證明Treg浸潤(rùn)相關(guān)基因模塊可用于建立TNBC進(jìn)展的臨床相關(guān)分類(lèi)逆害。本研究揭示了TK1作為腫瘤生物標(biāo)記物和免疫治療靶點(diǎn)的潛力头镊。研究流程如下：

研究結(jié)果：

正常乳腺上皮細(xì)胞和TNBC組織的scRNA-seq分析

從GSE125449中提取并重新分析了21個(gè)樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)。在這些樣本中魄幕，13個(gè)來(lái)自正常乳腺組織相艇，8個(gè)來(lái)自TNBC，基于細(xì)胞marker定義了六個(gè)細(xì)胞群（圖A）纯陨。為探索NKT細(xì)胞的異質(zhì)性坛芽，作者將NKT細(xì)胞進(jìn)一步分為5群（圖B）。由于Treg細(xì)胞有利于腫瘤抑制性微環(huán)境的形成翼抠，而腫瘤抑制性微環(huán)境會(huì)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展并降低對(duì)免疫療法的反應(yīng)咙轩，因此作者探討了腫瘤形成過(guò)程中Treg細(xì)胞浸潤(rùn)的變化，發(fā)現(xiàn)與正常乳腺組織相比阴颖，Tregs在TNBC組織中的浸潤(rùn)明顯增加（圖C活喊、D）。

根據(jù)Treg浸潤(rùn)對(duì)TNBC腫瘤進(jìn)行分層

為了確定與Tregs浸潤(rùn)相關(guān)的關(guān)鍵標(biāo)記基因量愧，作者使用CIBERSORT算法對(duì)Treg浸潤(rùn)進(jìn)行量化胧弛，并使用WGCNA檢測(cè)與Treg浸潤(rùn)相關(guān)的基因模塊。在METABRIC隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)基因模塊侠畔，其中藍(lán)色基因模塊與Treg浸潤(rùn)呈正相關(guān)结缚，與患者生存狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)（圖A）。利用METABRIC隊(duì)列中的生存數(shù)據(jù)和藍(lán)色模塊基因的表達(dá)值软棺，作者使用單因素cox回歸使進(jìn)行了生存分析红竭，并確定了22個(gè)與Treg浸潤(rùn)相關(guān)的預(yù)后基因，然后根據(jù)這22個(gè)基因的表達(dá)值對(duì)METABRIC隊(duì)列中的患者進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)（圖B）與主成分分析（圖C）喘落。圖D熱圖顯示茵宪，這22個(gè)基因的表達(dá)模式在群組1和群組2之間存在差異。關(guān)聯(lián)臨床信息瘦棋，與群組1相比稀火，群組2患者的腫瘤分級(jí)、分期更高赌朋，生存狀況更差（圖E）凰狞。生存分析也顯示，Cluster2組的預(yù)后比Cluster1組差（圖F）沛慢∩娜簦考慮到TNBC患者可能對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，作者使用oncopredict包評(píng)估了這兩個(gè)群組對(duì)四種TNBC化療藥物的反應(yīng)团甲，發(fā)現(xiàn)群組1中的患者對(duì)這四種常見(jiàn)化療藥物更敏感（圖G）逾冬。

Treg浸潤(rùn)相關(guān)預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

為了促進(jìn)Treg浸潤(rùn)相關(guān)基因在預(yù)后中的臨床應(yīng)用，作者采用了LASSO和RF兩種機(jī)器學(xué)習(xí)算法從所有22個(gè)Treg浸潤(rùn)相關(guān)基因中分別篩選出17和13個(gè)關(guān)鍵基因，其中有7個(gè)交叉基因（圖A）身腻，多因素Cox回歸模型證明了其獨(dú)立危險(xiǎn)性（圖B）产还。隨后作者構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將METABRIC隊(duì)列中的患者分為兩組嘀趟，Treg浸潤(rùn)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者OS較差（圖C）雕沉，時(shí)間ROC曲線也展示了其良好的預(yù)測(cè)性能（圖F），這些結(jié)果在兩個(gè)外部隊(duì)列（GSE58812和SCAN-B）中得到了驗(yàn)證（圖D,E,G,H）去件。

高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組免疫相關(guān)特征的差異

為了揭示各風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組在通路激活方面的差異坡椒，作者計(jì)算了基于KEGG通路基因集的GSVA評(píng)分。圖A表明高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的代謝相關(guān)通路尤溜，而高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的免疫相關(guān)通路的活化程度較低倔叼。此外，METABRIC隊(duì)列和SCAN-B的CIBERSORT算法結(jié)果顯示宫莱，與低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者相比丈攒，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的B細(xì)胞和CD8T細(xì)胞浸潤(rùn)較低，但Treg細(xì)胞和M2-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較高（圖B）授霸。有趣的是巡验，高風(fēng)險(xiǎn)組的腫瘤突變負(fù)荷（TMB）水平低于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖C）。此外碘耳，作者還發(fā)現(xiàn)了免疫檢查點(diǎn)表達(dá)在低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異显设，顯示高風(fēng)險(xiǎn)組患者的免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)低于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖D）。最后辛辨，作者計(jì)算了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性捕捂，結(jié)果表明大多數(shù)基因與促進(jìn)免疫治療反應(yīng)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（B細(xì)胞、CD8T細(xì)胞）呈負(fù)相關(guān)斗搞，而與Treg細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)（圖E）指攒。

評(píng)估藥物和免疫療法反應(yīng)

作者收集了一個(gè)包含TNBC患者免疫治療數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集GSE173839。兔兔A表明免疫治療無(wú)反應(yīng)者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高于免疫治療有反應(yīng)者僻焚，圖B表明高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組免疫治療失敗的患者比例高于低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組允悦。此外，ROC曲線分析表明虑啤，Treg浸潤(rùn)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)性方面表現(xiàn)出色（圖C）隙弛。作者采用了使用CTRP和PRISM衍生的藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)來(lái)確定在Treg浸潤(rùn)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者中藥物敏感性較高的候選藥物。首先咐旧，在高Treg浸潤(rùn)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組和低Treg浸潤(rùn)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組之間進(jìn)行差異藥物反應(yīng)分析驶鹉，以確定在高Treg浸潤(rùn)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組中估計(jì)AUC值較低的化合物（log2FC>0.10）绩蜻。接下來(lái)铣墨，作者利用AUC值與Treg浸潤(rùn)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間的斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)，篩選出相關(guān)系數(shù)為負(fù)的化合物办绝。這些分析得出了10種CTRP衍生化合物（包括SGX-523伊约、DNMDP姚淆、tivozanib、AZD6482屡律、BRD-K04800985腌逢、PLX-4720、MK-0752超埋、MI-1搏讶、BRD-K33199242和TG-100-115）（圖Da）和4種PRISM衍生化合物（包括uprosertib、NVP-BEZ235霍殴、BAY-87-2243和temsirolimus）（圖Ea）媒惕。所有這些化合物在高Treg浸潤(rùn)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組的估計(jì)AUC值都較低，并且與Treg浸潤(rùn)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分成反比（圖Db来庭、Eb）妒蔚。

諾曼圖建立和評(píng)估

為了提高上述風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)測(cè)能力，將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和腫瘤大小結(jié)合起來(lái)月弛，利用多因素cox回歸分析建立了一個(gè)諾曼模型（圖A）肴盏。1年、2年帽衙、3年和5年的疾病特異性生存（DSS）校正曲線顯示菜皂，預(yù)測(cè)的生存概率與實(shí)際生存率一致，證明了該提名圖在預(yù)測(cè)生存方面的穩(wěn)健性（圖A）厉萝。此外幌墓，作者還進(jìn)行了DCA分析，結(jié)果顯示諾曼圖的預(yù)后價(jià)值優(yōu)于單個(gè)變量的預(yù)后價(jià)值（圖A）冀泻。在訓(xùn)練集和測(cè)試組中常侣，諾曼圖預(yù)測(cè)的AUC均超過(guò)了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（圖B-E）。

TK1是TNBC的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分因子和腫瘤促進(jìn)因子

空間轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示弹渔，TK1陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞主要定位于腫瘤細(xì)胞胳施。此外，在TK1高表達(dá)的TNBC組織中肢专，Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)也有所升高（圖A舞肆、B）。為了檢測(cè)TK1表達(dá)與Tregs之間的關(guān)系博杖，作者采用Treg標(biāo)記物FOXP3多重?zé)晒馊旧▽?duì)31例TNBC患者進(jìn)行了評(píng)估椿胯。不出所料，TK1的表達(dá)與Treg標(biāo)記物FOXP3的表達(dá)狀態(tài)呈正相關(guān)（圖C-E）剃根。這一結(jié)果表明哩盲，TK1表達(dá)較高的患者表現(xiàn)出更多的Treg浸潤(rùn)。

隨后作者分析了TCGA泛癌癥隊(duì)列中TK1與Hallmark通路之間的關(guān)系。在多種癌癥類(lèi)型中廉油，TK1與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)通路（如MYC靶點(diǎn)和MTORCI信號(hào)通路）呈正相關(guān)（圖A）惠险。同時(shí)作者分析了TCGA隊(duì)列中20種癌癥類(lèi)型的腫瘤和正常組織中TK1的表達(dá)情況；70%的腫瘤中TK1上調(diào)抒线，包括BLCA班巩、UCEC、HNSC嘶炭、PRAD抱慌、KIRP、COAD眨猎、LUSC遥缕、KIRC、LIHC宵呛、BRCA单匣、THCA、LUAD宝穗、CHOL户秤、ESCA和STAD（圖B）。生存分析表明逮矛，TK1的高表達(dá)與10多種癌癥較差的預(yù)后相關(guān)（圖C）鸡号。

為了驗(yàn)證TK1在TNBC中作為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的關(guān)鍵角色以及腫瘤啟動(dòng)子的作用，作者進(jìn)行了幾項(xiàng)功能實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)對(duì)照組和siRNA介導(dǎo)敲除組的遷移须鼎、侵襲和增殖能力鲸伴。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，TK1在癌癥組織中高表達(dá)（圖A）晋控。為了探索TK1在體外TNBC增殖和遷移中的作用汞窗，研究人員采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向TK1的方法抑制其表達(dá)（si-TK1-1和si-TK1-2）。TK1敲除后赡译，TNBC細(xì)胞的遷移仲吏、侵襲和增殖能力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義蝌焚。與對(duì)照組相比裹唆，CCK-8（圖D）和集落形成實(shí)驗(yàn)（圖E）結(jié)果顯示，沉默TK1分別顯著降低了TNBC細(xì)胞的活力和增殖能力只洒。此外许帐，傷口愈合試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)的結(jié)果也顯示，與對(duì)照組相比毕谴，TK1敲除后細(xì)胞的遷移能力下降（圖C成畦、F）距芬。總之羡鸥，這些發(fā)現(xiàn)共同證實(shí)了TK1能促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖和遷移蔑穴。

研究總結(jié)：

在這項(xiàng)研究中忠寻，作者證明了TNBC中的Treg浸潤(rùn)相關(guān)基因可用于建立與臨床相關(guān)的TNBC分類(lèi)惧浴。基于三個(gè)TNBC隊(duì)列奕剃，開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了與Treg浸潤(rùn)相關(guān)的預(yù)后模型衷旅，確定了Treg浸潤(rùn)相關(guān)基因在腫瘤免疫微環(huán)境的發(fā)展和免疫治療反應(yīng)中的作用。此外纵朋，作者還發(fā)現(xiàn)與Treg浸潤(rùn)相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)且藥物敏感性較高的候選藥物柿顶，它們可以預(yù)測(cè)TNBC的臨床結(jié)果和免疫治療反應(yīng)。最終操软，作者通過(guò)表型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Tregs可能通過(guò)調(diào)節(jié)TME內(nèi)TK1的表達(dá)來(lái)影響腫瘤的發(fā)生嘁锯、發(fā)展和預(yù)后。最終得出結(jié)論：Treg浸潤(rùn)相關(guān)預(yù)后模型可以拓寬我們對(duì)TNBC生物學(xué)和預(yù)后預(yù)測(cè)的理解聂薪，靶向Tregs是治療TNBC的一種很有前景的方法家乘。