1、自噬的定義：細(xì)胞自噬是真核生物中進(jìn)化保守的對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過(guò)程憾儒。該過(guò)程中一些損壞的蛋白或細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后尖滚，送入溶酶體(動(dòng)物）或液泡（酵母和植物）中進(jìn)行降解并得以循環(huán)利用。

2休吠、自噬的過(guò)程：從一張圖片開(kāi)始：

步驟1：細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)后谒获，在胞漿的某處形成一個(gè)小的類(lèi)似“脂質(zhì)體”樣的膜結(jié)構(gòu)蛤肌，然后不斷擴(kuò)張，但它并不呈球形批狱，而是扁平的寻定，就像一個(gè)由2層脂雙層組成的碗，可在電鏡下觀察到精耐，被稱(chēng)為Phagophore，是自噬發(fā)生的鐵證之一琅锻。

步驟2：Phagophore不斷延伸卦停，將胞漿中的任何成分，包括細(xì)胞器恼蓬，全部攬入“碗”中惊完，然后“收口”，成為密閉的球狀的autophagosome处硬，我把它翻譯為“自噬體”小槐。電鏡下觀察到自噬體是自噬發(fā)生的鐵證之二。有2個(gè)特征：一是雙層膜荷辕，二是內(nèi)含胞漿成分凿跳，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等疮方。

步驟3：自噬體形成后控嗜，可與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡和內(nèi)體融合（加了個(gè)“可”字骡显，意思是這種情況不是必然要發(fā)生的）疆栏。

步驟4：自噬體與溶酶體融合形成autolysosome曾掂，期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，2者的內(nèi)容物合為一體壁顶，自噬體中的“貨物”也被降解珠洗，產(chǎn)物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中若专，供細(xì)胞重新利用许蓖，而殘?jiān)虮慌懦黾?xì)胞外或滯留在胞漿中。

3富岳、自噬的特性：

1）自噬是細(xì)胞消化掉自身的一部分蛔糯，即self-eating，初一看似乎對(duì)細(xì)胞不利窖式。事實(shí)上蚁飒，細(xì)胞正常情況下很少發(fā)生自噬，除非有誘發(fā)因素的存在萝喘。這些誘發(fā)因素很多淮逻，也是研究的熱門(mén)。既有來(lái)自于細(xì)胞外的（如外界中的營(yíng)養(yǎng)成分阁簸、缺血缺氧爬早、生長(zhǎng)因子的濃度等），也有細(xì)胞內(nèi)的（代謝壓力启妹、衰老或破損的細(xì)胞器筛严、折疊錯(cuò)誤或聚集的蛋白質(zhì)等）。由于這些因素的經(jīng)常性存在饶米，因此桨啃，細(xì)胞保持了一種很低的、基礎(chǔ)的自噬活性以維持自穩(wěn)檬输。

2）自噬過(guò)程很快照瘾，被誘導(dǎo)后8min即可觀察到自噬體（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶體（autolysosome）基本降解消失丧慈。這有利于細(xì)胞快速適應(yīng)惡劣環(huán)境析命。

3）自噬的可誘導(dǎo)特性：表現(xiàn)在2個(gè)方面，第一是自噬相關(guān)蛋白的快速合成逃默，這是準(zhǔn)備階段鹃愤。第二是自噬體的快速大量形成，這是執(zhí)行階段笑旺。

4）批量降解：這是與蛋白酶體降解途徑的顯著區(qū)別

5）“捕獲”胞漿成分的非特異性：由于自噬的速度要快昼浦、量要大，因此特異性不是首先考慮的筒主，這與自噬的應(yīng)急特性是相適應(yīng)的关噪。

6）自噬的保守性：由于自噬有利于細(xì)胞的存活鸟蟹，因此無(wú)論是物種間、還是各細(xì)胞類(lèi)型之間（包括腫瘤細(xì)胞）使兔，自噬都普遍被保留下來(lái)（誰(shuí)不喜歡留一手呢建钥？）。

4虐沥、自噬過(guò)程的調(diào)控：從上面總結(jié)的自噬特點(diǎn)中可以看出熊经，自噬這一過(guò)程一旦啟動(dòng)，必須在度過(guò)危機(jī)后適時(shí)停止欲险，否則镐依，其非特異性捕獲胞漿成分的特性將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷。這也提醒我們?cè)谘芯孔允蓵r(shí)一定要?jiǎng)討B(tài)觀察天试，任何橫斷面的研究結(jié)果都不足以評(píng)價(jià)自噬的活性槐壳。目前，已經(jīng)報(bào)告了很多因素能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬喜每，如饑餓务唐、生長(zhǎng)因子缺乏、微生物感染带兜、細(xì)胞器損傷枫笛、蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或聚集、DNA損傷刚照、放療刑巧、化療等等，這么多刺激信號(hào)如何傳遞的无畔、哪些自噬蛋白接受信號(hào)海诲、又有哪些自噬蛋白去執(zhí)行等很多問(wèn)題都還在等待進(jìn)一步解答中。

關(guān)于傳遞自噬信號(hào)的通路目前比較肯定的有：

抑制類(lèi)

1）Class?I?PI3K?pathway（PI-phosphatidylinositol檩互，磷脂酰肌醇）與IRS?(Insulin?receptor?substrate)結(jié)合，接受胰島素受體傳來(lái)的信號(hào)（血糖水平高抑制自噬）

2）mTOR?pathway（mammalian?target?of?rapamycin）

mTOR在人類(lèi)中的同源基因是FRAP1（FK506?binding?protein?12-rapamycin?associated?protein?1）咨演，是一個(gè)絲/蘇氨酸蛋白激酶闸昨。能接受多種上游信號(hào)，如Class?I?PI3K薄风、IGF-1/2饵较、MAPK，能感受營(yíng)養(yǎng)和能量的變化,rapamycin是最典型最常用的自噬激動(dòng)劑.

激活類(lèi)

1）Class?III?PI3K

結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于Class?I?PI3K遭赂，但作用相反循诉。3-MA是Class?III?PI3K的抑制劑,因此3-MA可以作為自噬的抑制劑.

5、自噬的研究方法：正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低撇他，不適于觀察茄猫，因此狈蚤，必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)，經(jīng)報(bào)道的工具藥有：

（一）自噬誘導(dǎo)劑

? ?1）Bredeldin A /Thapsigargin / Tunicamycin?：?模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

2

）Carbamazepine/L-690划纽，330/ LithiumChloride（氯化鋰）：IMPase?抑制劑（即Inositolmonophosphatase脆侮，肌醇單磷酸酶）

3

）Earle's平衡鹽溶液：?制造饑餓

4

）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3KPathway抑制劑

5

）Rapamycin：mTOR抑制劑

6

）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

（二）自噬抑制劑

1

）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）?hVps34?抑制劑

2

）Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑

3

）Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumenalkalizer（溶酶體腔堿化劑）除了選用上述工具藥外，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù)：包括反義RNA干擾技術(shù)（Knockdown）勇劣、突變株篩選靖避、外源基因?qū)氲取?/p>

細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后，需對(duì)自噬過(guò)程進(jìn)行觀察和檢測(cè)比默，常用的策略和技術(shù)有：

1）觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)幻捏，普通光鏡下看不到，因此命咐，直接觀察自噬體需在透射電鏡下篡九。Phagophore的特征為：新月?tīng)罨虮瓲睿p層或多層膜侈百，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)瓮下。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分钝域，如線粒體讽坏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等例证。自噬溶酶體（AV2）的特征為：?jiǎn)螌幽ぢ肺兀麧{成分已降解。（autophagic?vacuole织咧，AV）

2）在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3等融合蛋白來(lái)示蹤自噬形成：(常用)

GFP-LC3單熒光指示體系：由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)胀葱，不利于監(jiān)測(cè)（Monitoring）自噬形成。我們利用LC3在自噬形成過(guò)程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出了GFP-LC3指示技術(shù)：無(wú)自噬時(shí)笙蒙，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中抵屿；自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜捅位，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)轧葛，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)自噬活性的高低艇搀。雙熒光指示體系：漢恒生物科技（上海）有限公司已開(kāi)發(fā)出用于表達(dá)mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒產(chǎn)品尿扯。mRFP用于標(biāo)記及追蹤LC3，GFP的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體焰雕，即由于GFP熒光蛋白對(duì)酸性敏感衷笋，當(dāng)自噬體與溶酶體融合后GFP熒光發(fā)生淬滅,此時(shí)只能檢測(cè)到紅色熒光。

3）利用Western?Blot檢測(cè)LC3-II/I比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成矩屁。

自噬形成時(shí)辟宗，胞漿型LC3（即LC3-I）會(huì)酶解掉一小段多肽爵赵，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此慢蜓，LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低亚再。

(Note：LC3抗體對(duì)LC3-II有更高的親和力，會(huì)造成假陽(yáng)性晨抡。方法2和3需結(jié)合使用氛悬，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響)

4)?利用Western?Blot檢測(cè)p62蛋白來(lái)評(píng)價(jià)自噬以及自噬流的強(qiáng)弱:起初自噬所降解的底物被認(rèn)為是隨機(jī)的,但是后來(lái)的研究表明有些蛋白是選擇性降解的,在這些蛋白之中研究的最為透徹的是p62蛋白，p62蛋白水平的多少與自噬流的強(qiáng)弱有著反比例關(guān)系耘柱。

5）MDC或者Cyto-ID染色：包括自噬體如捅，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的调煎。

6）Cell Tracker?TM?Green染色：主要用于雙染色镜遣，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的士袄。

6悲关、自噬體的發(fā)生：目前認(rèn)為，自噬體的膜不是直接來(lái)源于高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)娄柳，而是在胞漿中重新生成的寓辱，但具體的機(jī)制尚不清楚。當(dāng)beclin-1被活化后赤拒，胞漿中先形成很多個(gè)membrane source（自噬體膜發(fā)生中心）秫筏，在它們不斷擴(kuò)展的過(guò)程中(phagophore到autolysosome)，VMP1蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體轉(zhuǎn)位到自噬體膜上（VMP1又叫TMEM49挎挖，已知唯一與自噬有關(guān)的?跨膜蛋白）这敬，同時(shí)，MAP1-LC3由胞漿型（即LC3-I）轉(zhuǎn)位到自噬體膜（即LC3-II）蕉朵，LC3這一轉(zhuǎn)變過(guò)程可被Western Blot和熒光顯微鏡檢測(cè)到崔涂，現(xiàn)已成為監(jiān)測(cè)自噬體形成的推薦方法。

7始衅、自噬與細(xì)胞死亡的關(guān)系：

? ? ? 有必要說(shuō)明一下的是堪伍，細(xì)胞死亡是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，為了研究方便觅闽，需進(jìn)行分類(lèi)，但我們思考時(shí)不要局限于這些?人為的分類(lèi)涮俄，而應(yīng)注重于現(xiàn)象本身來(lái)研究其背后的機(jī)制蛉拙。

? ? ??一直以來(lái)人們從不同角度、用不同方法來(lái)觀察細(xì)胞的死亡彻亲，并把細(xì)胞的死亡方式分為2類(lèi)：壞死和凋亡孕锄，因?yàn)閮烧哂兄黠@的區(qū)別吮廉，其中最主要的區(qū)別之一就是細(xì)胞膜的通透性——壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜喪失了完整性，內(nèi)容物被釋放出來(lái)畸肆，染料可自由進(jìn)入細(xì)胞宦芦，而凋亡細(xì)胞保持完整，無(wú)內(nèi)容物釋放轴脐，染料也被排斥调卑。很多實(shí)驗(yàn)亦根據(jù)這一原理來(lái)設(shè)計(jì)以區(qū)分壞死和凋亡，這將在后面一一介紹大咱，如同剛剛說(shuō)明的那樣恬涧，這些實(shí)驗(yàn)只能說(shuō)明細(xì)胞膜的通透性（必要條件，不是充分必要條件）碴巾，而不能用來(lái)證實(shí)壞死細(xì)胞或凋亡細(xì)胞溯捆。一般認(rèn)為壞死是被動(dòng)的，不可控的厦瓢，而凋亡是主動(dòng)的提揍，可控的。為了強(qiáng)調(diào)這一點(diǎn)煮仇，凋亡被定義為程序性細(xì)胞死亡（program celldeath劳跃，PCD）。但無(wú)論是壞死還是凋亡欺抗，都是一個(gè)過(guò)程售碳，是需要時(shí)間的（尤其是凋亡，從啟動(dòng)到完成绞呈，細(xì)胞要執(zhí)行很多反應(yīng)）贸人，而且細(xì)胞死亡后都有“尸體”。

在研究自噬與凋亡的關(guān)系時(shí)佃声，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡前胞漿中存在大量的自噬體或自噬溶酶體艺智，但這樣的細(xì)胞缺乏凋亡的典型特點(diǎn)，如核固縮（pyknosis）,?核破裂（karyorhexis）圾亏、細(xì)胞皺縮（shrinkage）十拣、沒(méi)有凋亡小體的形成等，被稱(chēng)為自噬樣細(xì)胞死亡（autophagic celldeath志鹃，ACD）夭问，它是一種新的細(xì)胞程序性死亡，為了與凋亡區(qū)別曹铃，被命名為T(mén)ype II cell death缰趋，相應(yīng)的，凋亡為T(mén)ype I cell death，壞死為T(mén)ype III cell death秘血。盡管這樣味抖，但對(duì)于自噬是否是細(xì)胞死亡的直接原因目前還存在很大的爭(zhēng)議。到底是Cell death?by?autophagy（自噬引起死亡）還是Cell death?with?autophagy（死亡時(shí)有自噬發(fā)生灰粮，但不是直接原因）仔涩？對(duì)此，自噬研究領(lǐng)域“大耪持郏”級(jí)專(zhuān)家Levine Beth在一篇nature的Review中表達(dá)了自己的觀點(diǎn)熔脂。由于在形態(tài)學(xué)上2者無(wú)明顯區(qū)別，但通過(guò)阻斷自噬蓖乘，觀察細(xì)胞的結(jié)局可區(qū)分開(kāi)來(lái)：Cell death?by?autophagy細(xì)胞存活锤悄，而Cell death?with?autophagy細(xì)胞死亡。

8嘉抒、自噬與腫瘤的關(guān)系：

? ? ? 與凋亡（在腫瘤細(xì)胞中一般都存在缺限）不同零聚，自噬是被優(yōu)先保留的。無(wú)論是腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞些侍，保持一種基礎(chǔ)隶症、低水平的自噬活性是至關(guān)重要的醋界。因?yàn)榧?xì)胞中隨時(shí)產(chǎn)生的“垃圾”（破損或衰老的細(xì)胞器雄右、長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)鳖眼、錯(cuò)誤合成或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)等等）都需要及時(shí)清除刃跛，而這主要靠自噬來(lái)完成，因此叛甫，?自噬具有維持細(xì)胞自穩(wěn)的功能筹吐；如果將自噬相關(guān)基因突變失活痘儡，如神經(jīng)元會(huì)發(fā)生大量聚集蛋白刊咳，并出現(xiàn)神經(jīng)元退化彪见。同時(shí)，自噬的產(chǎn)物娱挨，如氨基酸余指、脂肪酸等小分子物質(zhì)又可為細(xì)胞提供一定的能量和合成底物，可以說(shuō)跷坝，?自噬就是一個(gè)“備用倉(cāng)庫(kù)”酵镜。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就會(huì)餓死。更重要的是柴钻，自噬活性可在代謝應(yīng)激（饑餓淮韭、生長(zhǎng)因子缺乏、射線贴届、化療等）時(shí)大大增強(qiáng)靠粪，表現(xiàn)為胞漿中迅速涌現(xiàn)大量自噬體足丢，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為“自噬潮”（autophagic flux），廣泛用于自噬形成的監(jiān)測(cè)庇配。自噬潮為細(xì)胞度過(guò)危機(jī)提供了緊急的營(yíng)養(yǎng)和能量支持，有利于細(xì)胞的存活绍些。

鑒于自噬的上述作用捞慌，自噬可為腫瘤細(xì)胞帶來(lái)幾大好處：

1

）腫瘤細(xì)胞本身就具有高代謝的特點(diǎn)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和能量的需求比正常細(xì)胞更高柬批，但腫瘤微環(huán)境往往不能如意啸澡，如腫瘤發(fā)生初始期到血管發(fā)生之前、腫瘤長(zhǎng)大發(fā)生血管崩塌時(shí)氮帐、腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶游走時(shí)等都會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不足或供應(yīng)中斷嗅虏，而此時(shí)提高自噬活性可以有助于度過(guò)這一危機(jī)。

2）當(dāng)化療上沐、放療后皮服，腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的破損細(xì)胞器、損壞的蛋白質(zhì)等有害成分参咙，而此時(shí)提高自噬活性可及時(shí)清除這些有害物質(zhì)龄广，并提供應(yīng)急的底物和能量為修復(fù)受損DNA贏得時(shí)間和條件。由于自噬減少了腫瘤細(xì)胞在代謝應(yīng)激時(shí)發(fā)生壞死的機(jī)會(huì)蕴侧，而對(duì)于腫瘤細(xì)胞群體而言择同，需要一部分細(xì)胞發(fā)生壞死，以引發(fā)適度的炎癥（有利于血管的長(zhǎng)入净宵、吸引免疫細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子等）敲才。研究發(fā)現(xiàn)，很多類(lèi)型的腫瘤在代謝應(yīng)激時(shí)會(huì)“組成性”活化PI3K信號(hào)以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻择葡，抑制自噬會(huì)促進(jìn)壞死）紧武，但具體機(jī)制尚不清楚。

自噬與腫瘤的關(guān)系可能是雙重的刁岸。①對(duì)不同的細(xì)胞脏里，自噬的作用可能不同。②相同的細(xì)胞在不同的外部因素作用時(shí)虹曙，自噬的作用可能不同迫横。③在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段，自噬的作用可能不同酝碳。腫瘤生長(zhǎng)的早期階段自噬增強(qiáng)矾踱，是由于此時(shí)腫瘤的血管化作用不足，癌細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供給有限疏哗，需要通過(guò)自噬為自身提供營(yíng)養(yǎng)呛讲。腫瘤進(jìn)入發(fā)展階段后基因變異積累，使包括?Beclin?1在內(nèi)的眾多抑癌基因失活，自噬活力降低贝搁。④對(duì)單個(gè)細(xì)胞和對(duì)整個(gè)腫瘤阻滯的作用可能不同吗氏。自噬功能不全的細(xì)胞易于壞死，但是壞死組織產(chǎn)生的細(xì)胞因子（包括部分生長(zhǎng)因子）反而會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)雷逆。上述各種假設(shè)均有待證實(shí)弦讽。腫瘤為細(xì)胞分化障礙性的疾病已得到肯定，但自噬在腫瘤細(xì)胞的分化抑制過(guò)程中起著什么樣的作用膀哲，自噬水平提高是抑制分化甚至導(dǎo)致去分化還是促進(jìn)分化等問(wèn)題尚未解決往产。

9、在研究自噬相關(guān)蛋白時(shí)某宪，需對(duì)其進(jìn)行定位仿村。由于自噬體與溶酶體、線粒體兴喂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蔼囊、高爾基體關(guān)系密切，為了區(qū)別瞻想，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來(lái)共定位：

Lamp-2：溶酶體膜蛋白压真，可用于監(jiān)測(cè)自噬體與溶酶體融合。

LysoTrackerTM探針：有紅或藍(lán)色可選蘑险，顯示所有酸性液泡滴肿。

pDsRed2-mito：載體，轉(zhuǎn)染后表達(dá)一個(gè)融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號(hào)）佃迄，可用來(lái)檢測(cè)線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）泼差。

MitoTracker探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經(jīng)過(guò)固定后還能保留呵俏。

Hsp60：定位與線粒體基質(zhì)堆缘，細(xì)胞死亡時(shí)不會(huì)被釋放。

Calreticulin（鈣網(wǎng)織蛋白）：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔 ?

Note：這些蛋白均為胞漿蛋白普碎，爬片或胰酶消化的細(xì)胞在做免疫熒光前需先透膜（permeabilize）吼肥，可采用0.1%SDS處理

自噬與細(xì)胞死亡經(jīng)常需一起考慮，下面介紹一些檢測(cè)細(xì)胞死亡的方法：

1）△ψmdissipation（線粒體跨膜電位的消失）：TMRM發(fā)紅色熒光麻车，DiOC6（3）發(fā)綠色熒光缀皱。

2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰絲氨酸外翻）：Annexin V-FITC（綠色）染細(xì)胞膜。

3）檢測(cè)線粒體產(chǎn)生的ROS：無(wú)熒光的HE（hydroethidine动猬，氫化乙啶）可被ROS氧化為EthBr（ethidium bromide啤斗，溴乙啡啶），發(fā)紅色熒光赁咙。NAO（nonylacridine orange钮莲，烷化吖啶橙免钻，可發(fā)熒光）能與非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反應(yīng)而失去熒光崔拥。

4）線粒體IMS蛋白的釋放：AIF极舔，細(xì)胞色素c，分別用熒光二抗染色链瓦。

5）Capase 3a?染色：用熒光二抗染色姆怪，胞漿彌散分布。

6）細(xì)胞膜完整性檢測(cè)：DAPI（藍(lán)色）澡绩、Hoechst 33342或PI（紅色）染核。胞膜完整的細(xì)胞（活細(xì)胞和早中期凋亡細(xì)胞）排斥俺附，可聯(lián)用annexin V肥卡。

10、如何用實(shí)驗(yàn)區(qū)分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy事镣？

第一步：利用上述方法證實(shí)細(xì)胞死亡

第二步：證實(shí)細(xì)胞死亡前發(fā)生了自噬

第三步：在形態(tài)學(xué)上區(qū)別開(kāi)“自噬樣死亡”與凋亡

第四步：利用遺傳學(xué)手段（反義RNA干擾Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具藥抑制自噬

第五步：細(xì)胞存活則為Cell death by autophagy步鉴，反之，細(xì)胞死亡則為Cell death with autophagy璃哟。

自噬的抑制根據(jù)自噬形成的過(guò)程氛琢，自噬的抑制也分為不同的階段，包括自噬的起始階段随闪，自噬泡和溶酶體融合階段阳似，以及溶酶體內(nèi)的降解階段。目前常用的一些抑制藥物如下：

? ??1）對(duì)自噬體形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制劑（如3-MA, Wortmannin铐伴，LY294002等）撮奏，這些藥物均可干擾或阻斷自噬體形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制劑当宴，可特異性阻斷Autophagy中自噬體的形成畜吊，被廣泛用作Autophagy的抑制劑。另外户矢，渥曼青霉素（Wortmannin）玲献、LY294002?也可用作Autophagy的抑制劑。? ??

? ? ? ?2）對(duì)自噬體與溶酶體融合的抑制：對(duì)自噬體與溶酶體融合過(guò)程進(jìn)行阻斷也能起著抑制自噬的作用梯浪，這些藥物有巴伐洛霉素A1捌年、長(zhǎng)春堿、諾考達(dá)唑等驱证。巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一種來(lái)源于灰色鏈霉菌的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素延窜，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特異性抑制劑抹锄，具有抗菌逆瑞、抗真菌荠藤、抗腫瘤等作用。當(dāng)突觸小泡經(jīng)歷胞外分泌時(shí)获高，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化哈肖。有研究表明，在已發(fā)生自噬的腫瘤細(xì)胞中加入巴伐洛霉素A1念秧，可使蛋白降解被抑制淤井，自噬體增多而自噬溶酶體數(shù)目減少，并且自噬體中的酸性磷酸酶的活性也明顯降低摊趾，從而證明其阻斷了自噬體與溶酶體的融合過(guò)程币狠。這種阻斷是可逆的，在去除了藥物作用后砾层，自噬體仍可以與溶酶體融合形成自噬溶酶體漩绵，繼續(xù)自噬進(jìn)程。

? ??3）對(duì)溶酶體降解的抑制:自噬體與溶酶體融合后最終被溶酶體中的水解酶水解肛炮，它首先經(jīng)過(guò)囊泡酸化止吐，達(dá)到所需的PH值后經(jīng)多種蛋白酶作用使囊內(nèi)容物降解，降解產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)利用侨糟。對(duì)溶酶體的降解進(jìn)行抑制碍扔，使得被降解的囊泡內(nèi)容物大量蓄積于溶酶體內(nèi)，而不能釋放出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)利用秕重，這也同樣起著抑制自噬的作用不同。因此，蛋白酶抑制劑溶耘，如E64d套鹅、Pepstatin A等，在抑制溶酶體降解的過(guò)程中發(fā)揮著自噬抑制劑的作用汰具。E64d和Pepstatin A均屬于蛋白酶抑制劑卓鹿，二者以1：1的比例聯(lián)用可以抑制自噬。有研究表明留荔，在結(jié)腸癌細(xì)胞系中聯(lián)用E64d及Pepstatin A吟孙，可明顯抑制溶酶體的降解從而阻斷自噬的進(jìn)展，而自噬體的形成并沒(méi)有受到明顯影響聚蝶。

11杰妓、自噬領(lǐng)域的大牛們：

? ?1）YoshinoriOhsumi博士。日本科學(xué)家碘勉，克隆了第一個(gè)酵母自噬基因Atg1以及LC3巷挥，主要成果在酵母模型下自噬研究；

2

）Daniel?J.?Klionsky博士验靡。美國(guó)科學(xué)家倍宾，主要成果在酵母模型的自噬研究雏节。最早在《Science》上發(fā)表綜述介紹自噬，2005年創(chuàng)辦了第一本自噬雜志《Autophagy》高职；2007年舉辦了第一次自噬國(guó)際會(huì)議钩乍，為自噬的宣傳做了大量工作。

3

）Noboru?Mizushima博士怔锌。日本科學(xué)家寥粹，2001年主要報(bào)道了Atg5的功能，被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物分子機(jī)制研究的第一環(huán)埃元，以及參與克隆自噬標(biāo)志物L(fēng)C3岛杀，而且制備了一些ATG基因敲除老鼠以及LC3轉(zhuǎn)基因老鼠裳瘪；

4

）Beth?Levine博士黄伊。美國(guó)科學(xué)家，首先克隆了第一個(gè)哺乳動(dòng)物自噬基因Beclin?1拓轻；

5

）Guido?Kroemer博士。法國(guó)科學(xué)家，是細(xì)胞凋亡和死亡領(lǐng)域中引用率第一的科學(xué)家达吞。在細(xì)胞凋亡研究中作出了卓越貢獻(xiàn)而且涉獵及其廣泛。目前也從事自噬研究瞒大，例如p53踢械，Bcl2家族與細(xì)胞自噬撵术。

6

）Tamotsu?Yoshimori博士交排。日本科學(xué)家埃篓，2000年克隆了目前廣泛使用的自噬標(biāo)志物L(fēng)C3文章的通訊作者，而且也參與了2010年ATG5機(jī)制研究部脚，是通訊作者之一案狠。在方法學(xué)上也有關(guān)鍵貢獻(xiàn)。目前主要研究ATG14和ATG16拉庵。值得注意的是茫蛹，上述三位日本科學(xué)家合作緊密，克隆了目前大部分的ATG基因，經(jīng)常共享文章通訊作者且警。

7

）Patrice?Codogno博士肩刃。法國(guó)科學(xué)家呢燥，2000年首先證實(shí)了PI3K信號(hào)通路在自噬的作用，I型抗自噬徙邻，III型促自噬排嫌，是自噬信號(hào)通路的開(kāi)拓者。

8

）Ana?Maria?Cuervo博士缰犁。美國(guó)科學(xué)家淳地，是分子伴侶自噬的開(kāi)拓者。

9

）David?Rubinsztein博士帅容。英國(guó)科學(xué)家颇象，2004年首次報(bào)道了mTOR與自噬的關(guān)系，抑制mTOR促進(jìn)自噬并徘。目前利用rapamycin誘導(dǎo)自噬成為經(jīng)典模型之一遣钳。2010年Nature的報(bào)道首次證實(shí)了自噬對(duì)mTOR的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

12麦乞、自噬信號(hào)通路：

? ?1）KEGG

? ?2）Abcam

? ?3）CST

? ?4) Enzo

13蕴茴、我在做自噬課題中的一些心得：

自噬小體的增多有兩種可能：一是形成增加即自噬被誘導(dǎo)劝评；另外一種是自噬體成熟受抑即自噬體不能和溶酶體結(jié)合。該怎么來(lái)判斷呢倦淀？

自噬體增多蒋畜，也就是“自噬潮”出現(xiàn)的原因一是形成增多，二是與溶酶體融合受阻（如使用了氫化氯喹或氯喹撞叽，另外姻成，溶酶體的酶抑制劑和質(zhì)子泵抑制劑的使用亦有可能影響溶酶體與自噬體或異噬泡的融合），使自噬體不能降解而積聚能扒，這種積聚造成的自噬體增多的效應(yīng)要大于自噬體誘導(dǎo)劑效應(yīng)的數(shù)倍之多佣渴。

鑒于這樣的原因，單純的GFP-LC3熒光斑點(diǎn)增多不足以作為自噬激活的證據(jù)初斑，可聯(lián)用多個(gè)方法來(lái)判斷：

? 1

）加用自噬體與溶酶體融合的抑制劑辛润，如氯喹，觀察自噬潮的變化见秤。

? 2

）或加用LC3和溶酶體示蹤物在熒光顯微鏡下觀察共定位情況砂竖。

? 3

）或Knockdown掉LAMP-2基因（溶酶體膜蛋白）。

? 4

）檢測(cè)胞漿長(zhǎng)壽蛋白的降解鹃答。

?WesternBlot

檢測(cè)LC3時(shí)除了上述的原因外乎澄，還有幾個(gè)需考慮到的地方：

1

）抗體的親和力：有報(bào)道認(rèn)為L(zhǎng)C3抗體對(duì)II型LC3的親和力較高

2

）結(jié)合于自噬體內(nèi)層膜的LC3-II在與溶酶體結(jié)合后被降解。

3

）自噬過(guò)程很快测摔，一個(gè)自噬體從產(chǎn)生到降解僅需2~3個(gè)小時(shí)或更短置济，其中自噬體形成階段更迅速，數(shù)分鐘即可完成锋八，而溶酶體降解階段耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)浙于。因此，設(shè)置多個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)（time frame）是非常重要的挟纱。