1. 技術產(chǎn)生背景

PacBio構建這種文庫的一個主要原因是邢享，在其測序芯片中有很多零模波導孔（ZMW），每個孔在測序時只能測一條DNA分子噩翠，這樣其測序通量就受到孔數(shù)和文庫長度的限制氛魁。近些年PacBio確實也在不停的增加ZMW孔的數(shù)目，從而來提升通量隆箩，ZMW孔的數(shù)目也從剛開始的3千個，一路增加到15萬個羔杨、100萬個和800萬個捌臊，即將在2023年上市的Revio機型，單個芯片會包含2500萬個ZMW孔兜材。

當然這對于DNA分子較長的文庫理澎，和所需測序數(shù)據(jù)量較高的項目來說沒有什么影響。但是實際中像細菌16S項目曙寡，全長的16S也只有1.5kb糠爬，或者轉錄組文庫，反轉錄后的DNA分子長度平均也就1.5-2kb左右卵皂。就目前測序的酶讀長秩铆，對于HiFi 15kb的文庫數(shù)據(jù)砚亭，平均測序準確性可以達到QV30左右灯变，即千分之一的錯誤率。如果文庫較短捅膘，雖然可以獲取更多的pass數(shù)添祸，經(jīng)過CCS矯正后具有較高的準確性，但是分子長度較短會使有效數(shù)據(jù)量變少寻仗，所以MAS-seq應運而生刃泌。

2. 文庫構建過程

MAS-seq文庫構建原理簡單介紹如下：

1. 構建樣本的短片段文庫，并將其平均分為多個獨立的子文庫署尤，下圖1是一個單細胞轉錄組文庫構建過程耙替，它分為了4個獨立的子文庫；
2. 在每個文庫中兩端添加不同的接頭曹体，例如cDNA1文庫的5'和3'分別添加AB接頭俗扇，cDNA2文庫的DNA分子5‘和3’分別添加B'C接頭，cDNA3添加C'D接頭箕别，cDNA4添加D'E接頭铜幽。再將這四個文庫混成一個文庫滞谢，由于BB'、CC'除抛、DD'反向互補狮杨，連接生產(chǎn)一個較長片段文庫；
3. 目前PacBio官方提供8個子文庫接頭試劑盒到忽，在15kb片段長度時就可以HiFi文庫可以得到較高測序質量的數(shù)據(jù)橄教，那么平均子文庫的長度長度15/8約等于2kb；

圖1. 單細胞轉錄組MAS-seq

3. MAS-seq數(shù)據(jù)拆分

PacBio測序儀可以支持Subreads類型下機數(shù)據(jù)和HiFi類型下機數(shù)據(jù)喘漏。兩者之間的區(qū)別是颤陶，HiFi數(shù)據(jù)是將同一個ZMW孔中相同分子多次測到的Subreads經(jīng)過合并糾錯后生成的，具有較高的準確性陷遮，這一步轉換稱為CCS過程滓走。在實際項目中，建議和服務商要求提供HiFi數(shù)據(jù)帽馋，因為這一轉換過程非常消耗CPU資源搅方。在CCS過程中，軟件是不會去除MAS-seq數(shù)據(jù)中的接頭序列的绽族。為了將接頭去除姨涡，獲取實際DNA分子的堿基序列，可以使用軟件Skera吧慢。拆分后的數(shù)據(jù)通常稱為Segmented reads.

圖2. Skera對MAS-seq數(shù)據(jù)拆分

5. 演示

官方提供了一組MAS-seq文庫結構的HiFi數(shù)據(jù)涛漂，我們可以拿過來學習，了解具體的輸入和輸出數(shù)據(jù)格式检诗，以及Skera軟件的用法匈仗。

# download HiFi reads for MAS-Seq PBMCs run on Sequel IIe
wget https://downloads.pacbcloud.com/public/dataset/MAS-Seq/DATA-SQ2-PBMC_5kcells/0-CCS/m64476e_220618_014917.hifi_reads.bam

# download MAS adapter fasta
wget https://downloads.pacbcloud.com/public/dataset/MAS-Seq/REF-MAS_adapters/MAS-Seq_Adapter_v1/mas16_primers.fasta

# run skera split to generate segmented reads
skera split m64476e_220618_014917.hifi_reads.bam mas16_primers.fasta segmented.bam

其中mas16_primers.fasta為包含adapter序列文件，文件中接頭序列的存放順序逢慌，必須按照多個小片段文庫連接生成最終長片段文庫中悠轩，adapter從5‘到3’的順序存放。

4. 輸出文件

skera split 運行完成后會生成很多文件攻泼，它們包含不同信息火架。

*summary.csv 輸出文件格式說明:

Input Reads,2622891  #輸入HiFI數(shù)據(jù)的總reads數(shù)嗎
Segmented Reads (S-Reads),40131832  #被分割后得到segmented Reads總數(shù)
Mean Length of S-Reads,672 #segmented reads平均長度
Percentage of Reads with Full Array,86.3247  #拆分時一條HiFi reads得到的segmented reads數(shù)與文庫設計一致的比例，本實例中包含15個segmented reads的HiFi reads數(shù)目占輸入條數(shù)的比例
Mean Array Size (Concatenation Factor),15  #文庫構建時完整HiFi reads理論包含segment數(shù)目

拆分數(shù)據(jù)時只輸出按照adapter順序連接的segment reads忙菠，例如官方提供的測試數(shù)據(jù)包含16個adapter何鸡，按照1-2，2‘-3牛欢，3’-4 ... 15‘-16 的方式加入到小片段文庫中骡男，然后通過2-2‘，3-3’ ... 15-15'粘性末端連接的方式將15條segment reads連接成一條長序列用于測序氢惋。由于在小片段文庫中添加adapter是獨立的洞翩，所以不應該產(chǎn)生1-3’稽犁、3-6‘這樣連接方式，在拆分時也不回輸出骚亿，下例中可以看出順序連接的數(shù)目也是最多的已亥。

sed 's/,/\t/g' m64476e_220618_014917.skera.ligations.csv|sort -k3,3rn | awk '{sum+=$3;print $0,sum}'|less -S

1       2       2579711 2579711
2       3       2569629 5149340
3       4       2555360 7704700
4       5       2548285 10252985
5       6       2535822 12788807
6       7       2522046 15310853
7       8       2509664 17820517
8       9       2502244 20322761
9       10      2495860 22818621
0       1       2494407 25313028
10      11      2490646 27803674
11      12      2486362 30290036
12      13      2481755 32771791
13      14      2478636 35250427
14      15      2475053 37725480
15      16      2406352 40131832
#只輸出上面連接的segmented reads
2       4       8220 40140052
7       16      3157 40143209
6       16      2915 40146124
1       3       2885 40149009
5       16      2327 40151336
...
...

segment.bam文件中包含去除adapter的數(shù)據(jù)，Skera還會在每個序列后面添加很多tag以表示不同的信息来屠。

另外，被分割生成的segment reads可以反向生成連接到一起的HiFi數(shù)據(jù)俱笛，由于去掉了非順序連接的segments reads捆姜，所以生成的undo bam會比原來的小：

skera undo *.skera.bam *undo.bam   #undo bam就是反向生成的HiFi數(shù)據(jù)的bam

6. 參考資料

1. https://www.pacb.com/products-and-services/applications/rna-sequencing/single-cell-rna-sequencing/
2. https://skera.how/read-segments.html