Identification of a Novel Prognostic Gene Signature From the Immune Cell Infiltration Landscape of Osteosarcoma
從骨肉瘤的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況中鑒定新的預(yù)后基因特征
發(fā)表期刊：Front Cell Dev Biol
發(fā)表日期：2021 06 September
DOI:10.3389/fcell.2021.718624
一、背景
????????近年來(lái)，腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用扰楼，受到了人們的關(guān)注拿撩。腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細(xì)胞波岛、成纖維細(xì)胞政溃、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞衣摩、各種信號(hào)分子和細(xì)胞外基質(zhì)卜录。最新研究表明戈擒，腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（ICI）與骨肉瘤（OS）患者的臨床結(jié)果有關(guān)。骨肉瘤的TME由骨細(xì)胞艰毒、基質(zhì)細(xì)胞筐高、血管細(xì)胞和免疫細(xì)胞組成。對(duì)TME的廣泛研究表明丑瞧，浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞在腫瘤擴(kuò)散柑土、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和免疫治療反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用绊汹。然而稽屏，浸潤(rùn)OS的免疫細(xì)胞的詳細(xì)情況尚未闡明。以前的研究主要集中在一兩種免疫細(xì)胞或關(guān)鍵基因上西乖，這可能會(huì)影響OS微環(huán)境的探究狐榔。從腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞圖譜中識(shí)別多個(gè)基因有助于構(gòu)建具有預(yù)后潛力更好且更準(zhǔn)確的基因特征。為了填補(bǔ)這一空白并找到針對(duì)OS預(yù)后的潛在診斷方法获雕，本研究基于ICI內(nèi)容對(duì)患者進(jìn)行聚類薄腻，以確定預(yù)后基因特征。
二典鸡、材料與方法
1.數(shù)據(jù)來(lái)源
訓(xùn)練隊(duì)列：TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取TARGET-OS（n=88）
驗(yàn)證隊(duì)列：GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的GSE21257數(shù)據(jù)集（n=53）
2.實(shí)驗(yàn)流程
三被廓、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.TICs的一致性聚類
????????作者采用了CIBERSORT和ESTIMATE算法坏晦。得到了所有OS樣本的ICI分布萝玷。從“ConsesusClusterPlus”R包生成的聚類結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)獨(dú)立的ICI亞型（圖2A）。更重要的是昆婿，在隨后的Kaplan–Meier分析中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)亞群之間存在顯著的生存差異（圖2B）球碉。總之仓蛆，ICI簇A與良好的預(yù)后相關(guān)睁冬，而ICI簇B的總生存期較短。
2.預(yù)后基因特征識(shí)別
????????使用“l(fā)imma”R包進(jìn)行了差異分析，以確定兩個(gè)ICI簇之間的轉(zhuǎn)錄組水平的差異從而揭示不同免疫表型的潛在生物學(xué)特征豆拨，共發(fā)現(xiàn)4501個(gè)DEGs直奋。在隨后的分析中，建立了Kaplan–Meier分析和單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型用來(lái)測(cè)試DEGs的預(yù)后能力施禾。在這兩項(xiàng)試驗(yàn)中脚线，僅將p值<0.05的DEGs作為潛在的預(yù)后基因，最終有15個(gè)基因被確定為潛在的預(yù)后基因弥搞。 然后將它們放入一個(gè)基于總體生存率的Cox模型邮绿，并進(jìn)行Lasso回歸分析（圖3A），以進(jìn)一步縮小和選擇攀例。Lasso算法輸出結(jié)果表明：當(dāng)模型有九個(gè)基因時(shí)船逮，它可以達(dá)到最佳性能（圖3B），每個(gè)基因的回歸系數(shù)由“glmnet”R包生成(表2)粤铭。
3.九個(gè)基因特征的驗(yàn)證
????????根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)將OS患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組挖胃。圖4展示了OS隊(duì)列中特征的整體視圖，包括風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布承耿、生存狀態(tài)/時(shí)間分布圖和基因表達(dá)熱圖冠骄。如圖4和圖S2所示，在訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中加袋，ANXA5凛辣、ZFP90、ATP6V1E1职烧、SELPLG扁誓、PLD3和IFNGR1與OS患者的良好預(yù)后相關(guān)，而DLEU2蚀之、UHRF2和PLCB4與不良預(yù)后相關(guān)蝗敢。
????????在 TARGET-OS 隊(duì)列和 GSE21257 隊(duì)列中構(gòu)建的 Kaplan-Meier 分析證明了高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間顯著的生存差異足删。以上分析都證明了高風(fēng)險(xiǎn)組的生存可能性要低于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖5）寿谴。
????????作者利用訓(xùn)練和驗(yàn)證隊(duì)列的可用臨床協(xié)變量（協(xié)變量包含：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、性別失受、年齡讶泰、種族、民族拂到、轉(zhuǎn)移狀態(tài)痪署、腫瘤部位和組織學(xué)亞型）構(gòu)建了單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，以驗(yàn)證九個(gè)基因特征的預(yù)后和獨(dú)立性能力（圖6）兄旬。在訓(xùn)練隊(duì)列中建立的Cox模型表明狼犯，在單變量和多變量分析中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是唯一的顯著影響OS預(yù)后的因素。與訓(xùn)練隊(duì)列一致悯森，驗(yàn)證隊(duì)列中Cox模型也證實(shí)了基因特征的強(qiáng)大預(yù)測(cè)能力宋舷。在該分析中，轉(zhuǎn)移因子也被證實(shí)具有預(yù)后能力瓢姻，但在其p值低于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分肥缔。基于上述證據(jù)汹来，可以合理地推斷出這九個(gè)基因特征具有很強(qiáng)的獨(dú)立預(yù)后能力续膳。
????????ROC曲線下的面積稱為AUC收班，目前被認(rèn)為是評(píng)估預(yù)測(cè)分布模型準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)方法坟岔。IAUC是一種有效的工具，可以根據(jù)個(gè)體在特定時(shí)間點(diǎn)的真實(shí)疾病狀態(tài)來(lái)評(píng)估候選標(biāo)記物的性能摔桦。IBS是模型預(yù)測(cè)的總體指標(biāo)社付。作者在這一步使用ROC曲線、IAUC和IBS來(lái)驗(yàn)證九個(gè)基因特征的預(yù)測(cè)能力邻耕，并將其與其他變量進(jìn)行比較鸥咖。如圖7A所示，對(duì)于在訓(xùn)練隊(duì)列中進(jìn)行的分析兄世，在1年啼辣、3年和5年時(shí)，基因特征的AUC分別為0.874御滩、0.830和0.883鸥拧，IAUC結(jié)果顯示，與所有時(shí)間點(diǎn)的所有其他因素相比削解，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分保持在更高的水平富弦。此外，IBS在整個(gè)過(guò)程中保持在最低水平氛驮。在1年腕柜、3年和5年的時(shí)間點(diǎn)，GSE21257（圖7B）的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分AUC=0.724矫废，并且在任何時(shí)候都大于其他變量盏缤。在任何時(shí)間該特征的IBS也低于其他臨床特征。以上結(jié)果表明磷脯，作者發(fā)現(xiàn)的基因特征優(yōu)于其他臨床因素蛾找。
4.九種基因特征與之前的模型的比較
????????作者選擇了9項(xiàng)研究作為對(duì)比赵誓。Kaplan–Meier曲線是根據(jù)作者的九個(gè)基因特征以及訓(xùn)練和驗(yàn)證隊(duì)列中的候選特征繪制的（圖8）。Kaplan–Meier圖表明，在TARGET-OS和GSE21257隊(duì)列中俩功，只有9個(gè)基因的特征和Yang研究中的特征可以預(yù)測(cè)預(yù)后幻枉。但是作者的9個(gè)基因特征的p值比Yang等人的p值更具有說(shuō)服力。此外诡蜓，在訓(xùn)練和驗(yàn)證隊(duì)列中使用這些基因特征建立了單變量Cox模型（圖9）熬甫。單變量Cox回歸結(jié)果顯示在這些隊(duì)列中，只有作者的9個(gè)基因特征具有預(yù)后能力蔓罚。從上面提到的證據(jù)來(lái)看椿肩，九個(gè)基因特征優(yōu)于之前研究的基因特征。
5.利用GSEA對(duì)基因特征進(jìn)行功能注釋
????????為了理解該特征潛在的分子機(jī)制郑象，作者對(duì)TARGET-OS隊(duì)列中的高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行了GSEA比較。在低風(fēng)險(xiǎn)組中均檢測(cè)到豐富的基因集茬末，主要參與與移植排斥反應(yīng)厂榛、凝血系統(tǒng)、IL-6/JAK/STAT3信號(hào)軸丽惭、藥物代謝击奶、炎癥反應(yīng)、干擾素反應(yīng)责掏、頂端連接復(fù)合體柜砾、上皮細(xì)胞頂端表面和先天免疫系統(tǒng)相關(guān)的機(jī)制。注釋分析表明换衬，兩組之間的差異與免疫有關(guān)局义，因此作者對(duì)22個(gè)TIC進(jìn)行了分析，以進(jìn)一步研究基因特征與免疫微環(huán)境之間的相互作用冗疮。
????????首先萄唇，采用CIBERSORT算法繪制22個(gè)TIC分布情況，為下一步分析做準(zhǔn)備术幔。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)（圖10A）發(fā)現(xiàn)了五種與基因特征相關(guān)的TICs另萤，斯皮爾曼系數(shù)（圖10B）發(fā)現(xiàn)了八種與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān)的TICs。然后構(gòu)建維恩圖來(lái)可視化這些結(jié)果诅挑，并發(fā)現(xiàn)有五個(gè)TIC（圖10C）展現(xiàn)出與基因特征風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分有顯著關(guān)聯(lián)四敞，分別是CD4 na?ve T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞拔妥、活化肥大細(xì)胞忿危、單核細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。具體來(lái)說(shuō)没龙，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與CD4 T細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞呈正相關(guān)铺厨，與其余的細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)缎玫。
? ? ? ? 作者通過(guò)Kaplan-Meier和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)一步測(cè)試了22例TIC的預(yù)后能力。Cox模型指出解滓，激活的肥大細(xì)胞不僅在單變量中影響OS結(jié)果赃磨，而且在多變量Cox回歸中也影響OS結(jié)果（圖11A）。除此之外洼裤，Kaplan-Meier分析表明活化的肥大細(xì)胞邻辉、CD4 T細(xì)胞和CD8 na?ve T細(xì)胞能夠預(yù)測(cè)OS的預(yù)后（圖11B）。活化的肥大細(xì)胞在OS中具有潛在的預(yù)后能力腮鞍。
? ? ? ?這一步顯示的所有分析結(jié)果顯示值骇，活化的肥大細(xì)胞不僅與基因特征顯著相關(guān)，而且還預(yù)測(cè)OS預(yù)后移国。因此雷客，活化的肥大細(xì)胞大量浸潤(rùn)可能在OS患者的九種基因特征的預(yù)后能力中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
四、結(jié)論
????????本研究從OS患者的ICI特征定義了一個(gè)新的九個(gè)基因特征，該特征與OS預(yù)后密切相關(guān)蘸秘，可以敏銳地確定OS患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。 此外部逮，作者通過(guò)將其應(yīng)用于一個(gè)獨(dú)立的驗(yàn)證隊(duì)列來(lái)證明該特征的穩(wěn)定性和廣泛適用性，并證明其優(yōu)于之前研究中的特征嫂易。 研究還確定了激活的肥大細(xì)胞在改特征的預(yù)后能力中的重要作用兄朋，可能會(huì)促進(jìn)OS治療方法的發(fā)掘。
