浪淘沙·DoTK

莫道磷酸如浪深

莫言酪氨似沙沉

超親富集不辛苦

吹盡狂沙始到金

摘要

三個腫瘤細胞系分別檢測到約1300 - 3000個pY位點婶恼，酪氨酸激酶(TK)數(shù)在15-47個之間

雙重復(fù)樣本有多達1155-2364個位點可重復(fù)檢測桑阶，定量相關(guān)系數(shù)R高達0.74-0.84

K-Score算法精準(zhǔn)預(yù)測激酶活性，TK進化樹可視化展示數(shù)據(jù)勾邦。

酪氨酸磷酸化是藥物靶點與信號通路研究中最重要的蛋白翻譯后修飾蚣录，沒有之一。特別是腫瘤藥物检痰，免疫藥物包归，所涉及的靶點和通路絕大部分受酪氨酸激酶調(diào)控，其中大部分是由酪氨酸激酶直接介導(dǎo)铅歼。長期以來公壤，對酪氨酸磷酸化的研究只能依賴磷酸化蛋白的抗體，以極低的通量去研究[1]椎椰。磷酸化位點的抗體特異性差厦幅，很多甚至沒有抗體慨飘。

質(zhì)譜技術(shù)可以無偏确憨，全面，高通量的檢測蛋白的磷酸化水平瓤的。遺憾的是休弃，金子般的酪氨酸磷酸化 (pY) 信號只占到所有磷酸化的~0.1%?[2]，湮沒在占比達99.9%的絲蘇氨酸磷酸化的黃沙之中圈膏。傳統(tǒng)的Fe, Ti金屬離子富集磷酸化的技術(shù)即使在10000個位點的檢測深度塔猾，也只能檢測到~10個左右的pY位點。這僅有的10個位點稽坤，且不說定量準(zhǔn)確性丈甸，重現(xiàn)性很差，它們所代表的高豐度信號意義非常有限尿褪。

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也有學(xué)術(shù)界實驗室試圖通過pY特異的抗體 (pTyr-100, pTyr-1000等) 去富集檢測睦擂。但抗體作為多達1000個氨基酸以上的超大分子，去區(qū)分并富集只有一個磷酸根區(qū)別的酪氨酸側(cè)鏈杖玲，頗有一點挖掘機摘花瓣的味道顿仇。其定量準(zhǔn)確性，穩(wěn)定性，重現(xiàn)性夺欲，都很難實現(xiàn)跪帝。再加上抗體天生的批次差異性和高昂的生產(chǎn)成本?[3]，抗體富集pY一直局限于少數(shù)實驗室小規(guī)模的課題檢測些阅。工業(yè)化或大隊列的pY抗體富集鮮有報道。

DeepKinase的DoTK技術(shù)平臺斑唬，利用專利技術(shù)SH2 Superbinder超親體富集pY市埋，首次實現(xiàn)了穩(wěn)定，特異恕刘，可重現(xiàn)的工業(yè)級pY組學(xué)檢測?[4]缤谎。基于檢測到的磷酸化信息褐着，輔以DeepKinase獨有的K-Score激酶活性預(yù)測算法坷澡，我們對樣本的激酶活性進行全面評估和深度挖掘，為藥物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)含蓉，臨床診斷和干預(yù)提供全新的視角频敛。

為了測試SH2 Superbinder的富集效果，我們選用了三個腫瘤細胞系：

MKN45：人胃癌細胞

A549：人肺癌肺泡基底上皮細胞

Ramos: ?人B淋巴細胞瘤細胞

經(jīng)過過氧化氫和過釩酸鈉處理后的細胞沉淀樣品馅扣，進行提取蛋白和酶切處理后斟赚，統(tǒng)一采用起始量為200ug的總肽段進行磷酸化酪氨酸肽段的富集。兩次生物重復(fù)差油，采用不同的質(zhì)譜平臺測試分析拗军。每個樣本都是一次進樣，沒有進行分級增加鑒定深度蓄喇，同時增加了定量準(zhǔn)確性发侵。（原始數(shù)據(jù)已上傳到PRIDE: PXD037088）。

如圖所示妆偏，這六個樣本我們分別檢測到約1300 - 3000個pY位點刃鳄。MKN45細胞的pY位點數(shù)最豐富。其中檢測到的酪氨酸被磷酸化的酪氨酸激酶(TK)數(shù)在15-47個之間（人類基因組有約90個酪氨酸激酶[5]）楼眷。TK最多的是A459細胞铲汪。可推測罐柳，MKN45用較少的酪氨酸激酶種類掌腰，實現(xiàn)了較廣較高的總體酪氨酸磷酸化水平。而A549雖然更多酪氨酸激酶活化张吉，卻只有較窄較低的總體pY水平齿梁。

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兩個生物學(xué)重復(fù)的數(shù)據(jù)高度相關(guān)，體現(xiàn)了技術(shù)在高鑒定深度下的高重現(xiàn)性。

首先勺择，Venn維恩圖表明创南，在定性水平，多達1155-2364個位點可在兩個重復(fù)樣本中同時檢測到省核。

接著稿辙，散點圖表明，在定量水平气忠，相關(guān)系數(shù)R高達0.74-0.84邻储。

高鑒定深度下的高重現(xiàn)性為量化統(tǒng)計分析提供了可信可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

梅須遜雪三分白旧噪，雪卻輸梅一段香

三個不同的細胞系都是能夠無限生長的癌細胞系吨娜，又來源于不同的個體和組織器官。我們能通過酪氨酸磷酸化數(shù)據(jù)看到怎樣的個性與共性呢淘钟？

首先宦赠，下圖表明，這三個細胞系有共同的565個pY位點米母，也有各自獨有的322~1923個位點勾扭。

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接著，通過DeepKinase獨有的K-Score激酶活性預(yù)測算法爱咬，我們可以預(yù)測出三個細胞系共55個TK的活性尺借，其中28個為細胞系特異性激活的，體現(xiàn)了不同細胞系的激酶譜特征精拟。

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Ramos作為免疫來源的B淋巴細胞系燎斩，其BTK, SYK, HCK，ZAP70等免疫細胞特異的酪氨酸激酶高度活化蜂绎，而肺癌的A549和胃癌的MKN45則分別是RET, BMX, PTK2, ABL2和MET, EGFR, MST1R, SRC等激酶高度活化栅表。的確，文獻報道师枣，Ramos對BTK抑制劑敏感[6]怪瓶， A549可以通過聯(lián)用JAK抑制劑來克服EGFR抑制劑的耐藥[7]，而MKN45對MET抑制劑是高度敏感的[8]践美。

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通過激酶活性的分析洗贰，我們找到了細胞系特異的活性激酶，并可以在文獻中找到部分的驗證陨倡。其他被預(yù)測到敛滋，暫時沒有文獻研究驗證的新靶點值得去探索與研究。

從2001年“藥神之藥”格列衛(wèi)上市到2020年的20年間兴革，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了71個激酶靶向藥绎晃，其中44個是酪氨酸激酶抑制劑?[9]蜜唾。日益增加的研發(fā)管線和臨床試驗在不斷推出更多的新靶點的抑制劑，老靶點的新一代藥物庶艾，和現(xiàn)有藥物的新適應(yīng)癥袁余。

[References]

Phosphorylation State-Specific Antibodies. 2003 Mandell

Phosphotyrosine – a new protein modification 1982 Hunter

Quality Issues of Research Antibodies. 2016 Weller

Ultra-deep tyrosine phosphoproteomics enabled by a phosphotyrosine superbinder 2016 Bian et al.

The protein tyrosine kinase family of the human genome 2000 Robinson et al.

Next-generation Bruton's tyrosine kinase inhibitor BIIB091 selectively and potently inhibits B cell and Fc receptor signaling and downstream functions in B cells and myeloid cells 2021 Bame et al.

Inhibition of JAK1/2 can overcome EGFR-TKI resistance in human NSCLC 2020 Kim et al.

Signaling networks assembled by oncogenic EGFR and c-Met 2008 Guo et al.

Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design 2021 Attwood et al.