近日，北京生命科學(xué)研究所的韓霆團(tuán)隊(duì)與百濟(jì)神州固惯、DeepKinase研發(fā)團(tuán)隊(duì)合作的最新成果在Journal of Biological Chemistry上發(fā)表缴守。該項(xiàng)研究揭示了BTKi治療B細(xì)胞淋巴瘤的耐藥機(jī)制。研究表明：臨床上發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致BTKi耐藥的BTK突變—C481F贴捡、C481Y村砂、C481R和L528W，造成了BTK激酶活性的喪失础废，但并不影響B(tài)CR信號(hào)通路的功能發(fā)揮评腺；在BTK激酶活性喪失的情況下，B細(xì)胞淋巴瘤的生長和存活更加依賴Toll樣受體TLR9蒿讥。

研究背景

在B細(xì)胞發(fā)育過程中抛腕，抗原介導(dǎo)的BCR交聯(lián)誘導(dǎo)BTK活化担敌，活化的BTK誘導(dǎo)PLCγ2活化适袜，PLCγ2再通過水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸，提升細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平苦酱，進(jìn)而激活不同的轉(zhuǎn)錄程序，促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化颂跨，此過程即為BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程扯饶。

BTK是一種非受體酪氨酸激酶，臨床上已有針對(duì)該激酶的抑制劑用于B細(xì)胞淋巴瘤的治療钓丰，如ibrutinib每币、acalabrutinib和zanubrutinib等；其主要作用方式是通過結(jié)合到BTK的ATP結(jié)合位點(diǎn)梦鉴，對(duì)BTK的481位的半胱氨酸進(jìn)行共價(jià)修飾揭保，進(jìn)而抑制BTK的激酶活性，抑制BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)存筏，最終抑制腫瘤的生長味榛。在長期BTKi治療的過程中，患者會(huì)產(chǎn)生耐藥励负，臨床上已經(jīng)明確的耐藥機(jī)制是發(fā)生BTK突變继榆。雖然前人已經(jīng)研究了B細(xì)胞淋巴瘤對(duì)BTKi的耐藥機(jī)制，但是導(dǎo)致耐藥的多種BTK突變體對(duì)BTK的生物化學(xué)活性或功能的影響并不清楚略吨。

2022年9月29日翠忠，來自北京生命科學(xué)研究所的韓霆團(tuán)隊(duì)與百濟(jì)神州、DeepKinase的研發(fā)團(tuán)隊(duì)合作在Journal of Biological Chemistry雜志上發(fā)表了論文"BTK kinase activity is dispensable for the survival of diffuse large B-cell lymphoma"秽之，發(fā)現(xiàn)BTK突變體（C481F、C481Y跨细、C481R和 L528W）造成BTK激酶活性的喪失河质；在功能上，BTK激酶活性喪失的B細(xì)胞淋巴瘤更加依賴TLR9散休；通過Protac技術(shù)靶向降解激酶失活的BTK突變體乐尊，可以克服BTKi耐藥。

研究結(jié)果

在體外C481F/Y/R和L528W可損失BTK的激酶活性

為了探究BTK突變體對(duì)BTK激酶活性的影響昏滴，研究團(tuán)隊(duì)首先進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬：正常情況下对人，ATP的腺嘌呤環(huán)與BTK中T474側(cè)鏈和M477主鏈形成氫鍵；此外姻几，ATP的磷酸基團(tuán)通過與K430側(cè)鏈形成兩個(gè)氫鍵而被鎖定在BTK的活性位點(diǎn)上；而C481和L528殘基位于BTK的ATP結(jié)合口袋下方蛇捌，與ATP沒有直接相互作用（圖1A咱台、B）。當(dāng)BTK C481發(fā)生突變回溺，C481S不影響ATP的結(jié)合春贸，但當(dāng)C481被苯丙氨酸（C481F）混萝、酪氨酸（C481Y）或精氨酸（C481R）取代都會(huì)與ATP的糖環(huán)或磷酸基發(fā)生空間沖突（圖1B）。為了驗(yàn)證該模型的推測萍恕，采用熱位移實(shí)驗(yàn)（thermal shift assay）逸嘀，結(jié)果顯示ATP穩(wěn)定了BTK野生型（WT）、C481S和C481R的激酶結(jié)構(gòu)域允粤，但沒有穩(wěn)定BTK C481F崭倘、C481Y和L528W的激酶結(jié)構(gòu)域（圖1C、D）类垫。其次，進(jìn)行體外激酶活性分析阔挠，通過BTK激酶結(jié)構(gòu)域與PLCγ2多肽或者BTK的SH3結(jié)構(gòu)域蛋白共孵育飘庄，檢測ADP的產(chǎn)生，結(jié)果顯示：C481F购撼、C481Y跪削、C481R和L528W突變體與多肽或蛋白共孵育后，ADP的產(chǎn)生均顯著降低迂求，說明這些突變體均影響了BTK的激酶活性（圖1E）碾盐。

在DLBCL細(xì)胞中C481F/Y/R和L528W可損失BTK的激酶活性

體外驗(yàn)證顯示，BTK突變體影響B(tài)TK的激酶活性揩局，那么在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中毫玖，是否具有相同的作用？對(duì)此研究團(tuán)隊(duì)通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式在TMD8 凌盯、OCI-LY10細(xì)胞系中構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的BTK突變體（BTK WT, C481S/F/Y/R or L528W）或采用基因編輯技術(shù)構(gòu)建BTK L528W knock-in克隆付枫，聯(lián)合深度pY的蛋白組學(xué)分析（采用DeepKinase獨(dú)家專利的dSH2-superbinder pY富集技術(shù)）（圖2A）。研究結(jié)果顯示驰怎，在相對(duì)于親本細(xì)胞減少超過75%的pY肽中阐滩，有4個(gè)在C481F/Y/R中比較常見（圖2B），如BTK pY223（自磷酸化位點(diǎn)）县忌，在C481F/Y/R和L528W中幾乎呈現(xiàn)缺失的狀態(tài)（圖2C掂榔、D），說明在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中症杏，C481F/Y/R和L528W突變體也同樣影響B(tài)TK的激酶活性装获。

在惡行B細(xì)胞中BTK激酶失活性突變?nèi)钥删S持致癌性BCR信號(hào)通路運(yùn)行

體內(nèi)、外研究均顯示厉颤，BTK突變體影響B(tài)TK的激酶活性穴豫，而BTK參與BCR信號(hào)通路，BTK激酶活性增加逼友，誘導(dǎo)BCR通路下游分子的一系列活化或反應(yīng)精肃，最終促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的生長和分化潘鲫，那么BTK突變后影響B(tài)TK的激酶活性，是否進(jìn)而可影響B(tài)CR信號(hào)通路肋杖？研究團(tuán)隊(duì)從PLCγ2的酪氨酸磷酸化和胞內(nèi)Ca2+流兩個(gè)方面（BCR通路下游的2個(gè)分子），來探究BTK突變對(duì)BCR信號(hào)通路的影響挖函；主要通過采用WB状植、流式細(xì)胞術(shù)和基因敲除技術(shù)分別檢測PLCγ2的酪氨酸磷酸化水平和胞內(nèi)Ca2+流強(qiáng)度；結(jié)果顯示：1. BTK突變后激酶活性損失怨喘，并不影響PLCγ2的酪氨酸磷酸化（圖2C津畸、D）；2. BTK突變體中BTK激酶活性的損失必怜，并不能有效影響胞內(nèi)Ca2+流強(qiáng)度變化（圖3A肉拓、B），通過基因敲除BTK后梳庆，胞內(nèi)Ca2+流強(qiáng)度被有效降低暖途，并在基因敲入對(duì)應(yīng)BTK突變體后，又表現(xiàn)出胞內(nèi)Ca2+流強(qiáng)度的回升（圖3C膏执、D）驻售。

綜上：BTK突變導(dǎo)致的BTK激酶活性的改變不能影響B(tài)CR信號(hào)通路，即BTK的激酶活性并不是BCR信號(hào)通路調(diào)節(jié)所必須的更米。

BTK激酶失活性突變避不開BCR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)

BTK突變導(dǎo)致的BTK激酶活性損失欺栗，不能有效調(diào)節(jié)BCR信號(hào)通路，那么BTK突變體是否是避開了BCR通路征峦，通過其它方式調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長或存活的迟几？對(duì)此研究團(tuán)隊(duì)通過基因敲除BCR通路下游的一些關(guān)鍵基因，探究TMD8 親本細(xì)胞和TMD8 BTK L528W knock-in細(xì)胞的活性變化栏笆，結(jié)果顯示兩種細(xì)胞活性變化趨勢完全一致类腮，即隨著基因敲除時(shí)間的延長，細(xì)胞活性同等程度的降低（圖4B）竖伯。說明BTK突變細(xì)胞同BTK正常細(xì)胞一樣存哲，均需要通過BCR通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和增殖，但BTK突變體具體通過怎樣的方式參與調(diào)節(jié)BCR通路七婴，目前還不清楚祟偷，需要做進(jìn)一步研究。

另外打厘，研究團(tuán)隊(duì)通過PROTAC靶向蛋白降解技術(shù)修肠，通過降解BTK突變體，進(jìn)一步降低細(xì)胞活性（TMD8和OCI-LY10 細(xì)胞）（圖4D）户盯，在一定程度上說明：靶向蛋白降解激酶失活的BTK突變體嵌施，可以克服BTKi長期治療帶來的耐藥作用饲化。

BTK激酶失活的DLBCL 細(xì)胞的生長/存活是TLR9依賴性的

最后，BTK激酶失活性突變體除了通過暫不清楚的方式參與調(diào)節(jié)BCR信號(hào)通路吗伤，是否在基因水平也起著相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用吃靠，對(duì)此，研究團(tuán)隊(duì)通過全基因組CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)BTK激酶失活的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長或存活更依賴于TLR9信號(hào)足淆。有研究表明巢块，BCR也可以與TLR9和MYD88形成超級(jí)復(fù)合體，說明BTK具有介導(dǎo)BCR和TLR9之間的交聯(lián)對(duì)話作用巧号，但具體作用機(jī)制也尚不清楚族奢，需要進(jìn)行后續(xù)研究。

韓霆團(tuán)隊(duì)的此項(xiàng)研究工作丹鸿，采用各種技術(shù)越走，包括體外的結(jié)構(gòu)模型分析、細(xì)胞的基因編輯技術(shù)靠欢、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建以及深度pY的蛋白組學(xué)分析等廊敌，進(jìn)行BTK激酶活性在B細(xì)胞淋巴瘤中作用的問題探究，為后續(xù)BTK在各種形式的B細(xì)胞惡性腫瘤中的非催化功能研究奠定了基礎(chǔ)掺涛。

此外庭敦，該論文在同行評(píng)議過程中也受到reviewers的高度評(píng)價(jià)，并推薦入選JBC當(dāng)期“Editors'Picks”薪缆，凸顯其對(duì)BTKi耐藥性機(jī)制研究領(lǐng)域的重要意義秧廉。

DeepKinase通過專利技術(shù)SH2-superbinder富集樣本中磷酸化的酪氨酸多肽，進(jìn)行質(zhì)譜檢測拣帽，后續(xù)結(jié)合DoTK等技術(shù)平臺(tái)疼电，實(shí)現(xiàn)對(duì)酪氨酸磷酸化多肽的深度組學(xué)分析。本研究中通過對(duì)酪氨酸磷酸化多肽的深度組學(xué)分析减拭，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞水平蔽豺，探究BTK突變體和非突變體在磷酸化酪氨酸多肽水平的差異，并快速找出后續(xù)的分析靶點(diǎn)拧粪，相較于傳統(tǒng)的基于抗體的酪氨酸磷酸化多肽的檢測方案修陡，省時(shí)、省力可霎、省成本魄鸦，且檢測范圍相對(duì)更廣。

關(guān)于韓霆課題組

韓霆課題組專注于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新型的抗癌小分子藥物癣朗。主要研究興趣包括：（1）分子膠水類藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)拾因；（2）癌癥治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。結(jié)合高通量藥物篩選，正向遺傳學(xué)绢记，化學(xué)生物學(xué)和生物化學(xué)重組扁达，以獲得癌癥生物學(xué)的新見解，并為癌癥治療提供新的和有效的藥物蠢熄。曾在Nat Chem Biol（2020跪解，2016）、J Am Chem Soc（2019）签孔、Science（2017惠遏，2010a，2010b）骏啰、PNAS（2022，2015抽高，2009）判耕、Cell（2014）、 Cell Res（2014）翘骂、Cell Metab（2008）等知名學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表多篇文章壁熄。