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直奔主題
基因家族分析（1）——基因家族成員的確定①簡(jiǎn)單介紹了一下分析策略和數(shù)據(jù)下載墙基。
今天就隨便找一篇文章，通過(guò)實(shí)踐操作來(lái)快速重復(fù)出文章的主要結(jié)果趾盐。
那就以下面這篇文章為例搬泥，事先沒(méi)有看，直接進(jìn)行分析唯沮。
Genome-wide analysis of the potato Hsp20 gene family: identification, genomic organization and expression profiles in response to heat stress.DOI: 10.1186/s12864-018-4443-1
第一步：由于是對(duì)馬鈴薯Hsp20基因家族進(jìn)行鑒定和分析脖旱，所以堪遂，首先需要下載馬鈴薯基因組的相關(guān)數(shù)據(jù)，下載方法在基因家族分析（1）——基因家族成員的確定①中已經(jīng)提及萌庆。
進(jìn)入EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(kù)http://plants.ensembl.org/info/data/ftp/index.html搜索Solanum tuberosum溶褪，下載這幾項(xiàng)即可。
因?yàn)橹跋螺d過(guò)践险，就不重復(fù)下載了猿妈，就是下面的四個(gè)文件。
第二步：從Pfam網(wǎng)站https://pfam.xfam.org/下載Hsp20的隱馬爾可夫模型巍虫。
ps.感興趣的可以用記事本打開(kāi)這個(gè)Hsp20.hmm看看彭则。
第三步：即用下載好的hmm模型作為query，來(lái)搜索馬鈴薯蛋白序列數(shù)據(jù)占遥。在這里就需要用到hmmer子程序hmmsearch俯抖。
（具體安裝這里先不寫(xiě)，感興趣的可以自行解決筷频，很簡(jiǎn)單蚌成，稍微百度就可以，和一般的程序安裝差不多凛捏。但其實(shí)很多大佬早就把基于命令行的操作打包在便于Windows下操作的軟件中了担忧，這里不得不提CJ大神開(kāi)發(fā)的Tbtools，但是我沒(méi)有用過(guò)這個(gè)軟件里面的hmmsearch功能坯癣，但由于Tbtools的操作過(guò)于簡(jiǎn)單瓶盛，就不進(jìn)行操作了，感興趣可自行操作示罗。另外還有SPDE惩猫，也是一位大佬一直打磨的軟件，應(yīng)該也有很多功能蚜点，但是我從來(lái)沒(méi)用過(guò)任何相關(guān)功能轧房，感興趣的都可以去搜一下。）
3.1 先使用基于ubuntu/Linus環(huán)境绍绘，在Windows中操作奶镶，由于還要安裝ubuntu等，我也忘記怎么安裝了陪拘，所以感興趣的自己琢磨安裝即可厂镇，很簡(jiǎn)單。
由于我安裝過(guò)左刽，界面如下：
然后運(yùn)行以下命令行即可捺信。
hmmsearchHSP20.hmmSolanum_tuberosum.SolTub_3.0.pep.all.fa>St_hmmsearch_hsp20.out
很簡(jiǎn)單，輸入代碼之后回車(chē)即可欠痴。沒(méi)錯(cuò)迄靠，一行命令即可完成搜索秒咨，由于命令行過(guò)于簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)單解釋一下梨水，hmmsearch：使用hmm模型搜索拭荤；HSP20.hmm：剛才下載的模型文件；Solanum_tuberosum.SolTub_3.0.pep.all.fa：馬鈴薯蛋白序列文件疫诽；St_hmmsearch_hsp20.out為輸出結(jié)果文件，可以自行命名旦委，以.out結(jié)尾奇徒。
運(yùn)行結(jié)束后，即可生成St_hmmsearch_hsp20.out文件缨硝。如下：
將該文件用記事本打開(kāi)（由于這個(gè)文件很小摩钙，記事本可以輕松打開(kāi)，但由于記事本太不友好查辩，因此胖笛，這里推薦使用Notepad軟件（安裝很容易，搜索下載并安裝即可）打開(kāi)文本文檔）宜岛。打開(kāi)后如下：
這里展示了幾列信息长踊，很好辨識(shí)，左邊三列是全序列比對(duì)結(jié)果（按score從高到低排序）萍倡，紅框中的三列是hmm模型結(jié)構(gòu)域最佳匹配結(jié)果（排序同上）身弊。
這里我們主要以紅色框中的搜索結(jié)果為準(zhǔn)，由于搜索到的序列較少列敲，故不以e值限制（一般以10-5進(jìn)行限制）阱佛，即將搜索到的結(jié)果全部保留。
第四步：文章中還通過(guò)擬南芥hsp20基因作為query進(jìn)行本地blastp馬鈴薯蛋白序列戴而。通過(guò)查看文章附件發(fā)現(xiàn)凑术，附件一包含擬南芥hsp20基因家族的ID信息。
下載后打開(kāi)附件
紅色方框中即為我們需要的信息所意。得到了擬南芥hsp20基因ID淮逊，接下來(lái)肯定要獲取擬南芥hsp20基因家族成員的蛋白序列，這里就不得不提Cj博士的Tbtools軟件了扁眯。
操作之前需要說(shuō)明壮莹，由于同一基因在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中會(huì)有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，例如經(jīng)常見(jiàn)到的基因A.1?? ?A.2? ? A.3姻檀，其實(shí)這三個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本是同一個(gè)基因命满，所以習(xí)慣上經(jīng)常取最長(zhǎng)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄本作為該基因的代表。都說(shuō)清楚了绣版，就請(qǐng)大家閱讀Cj博士的文章TBtools: An Integrative Toolkit Developed for Interactive Analyses of Big Biological Data胶台，了解tbtools歼疮，并下載安裝該軟件。
馬鈴薯基因組似乎每個(gè)基因都只保留了一個(gè)轉(zhuǎn)錄本诈唬，所以就不需要取最長(zhǎng)序列作為代表韩脏。直接進(jìn)行操作。
4.1打開(kāi)tbtools铸磅，獲取擬南芥每個(gè)基因的最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本赡矢。（當(dāng)然，剛才下載馬鈴薯基因組信息的時(shí)候阅仔，也要下載擬南芥的基因組信息）
start后即可生成以最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本為代表的擬南芥蛋白序列數(shù)據(jù)吹散。
接下來(lái)獲取擬南芥hsp20基因蛋白序列（At_hsp20）
start之后得到At_hsp20.fasta文件，即為獲取到的蛋白序列八酒。
記事本打開(kāi)后如下：
4.2 本地blastp空民，這里需要下載本地blast軟件⌒呙裕看起來(lái)需要安裝的軟件還蠻多的界轩，那就這里也先不提軟件安裝了，等有機(jī)會(huì)統(tǒng)一寫(xiě)一下全部軟件的安裝衔瓮。
首先浊猾，輸入如下代碼，先建立馬鈴薯蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)报辱。
makeblastdb-inSolanum_tuberosum.SolTub_3.0.pep.all.fa-dbtypeprot-outref
出現(xiàn)這三個(gè)文件即表示建庫(kù)成功与殃。
然后進(jìn)行本地blastp，輸入如下代碼：
blastp -query At_hsp20.fasta -dbref-evalue1e-5-num_threads4-max_target_seqs5-outblast_hsp20.txt -outfmt6
輸出文件即為比對(duì)結(jié)果碍现。打開(kāi)后如下：
第五步：通過(guò)第三步獲得了hmmsearch后得到的St_hsp20基因家族成員幅疼，通過(guò)第四步獲得了本地blastp后得到的St_hsp20基因家族成員。接下來(lái)昼接，就需要將兩種方式獲得的基因進(jìn)行合并爽篷，去掉重復(fù)值，注意慢睡，這里僅僅是去掉重復(fù)值逐工，并不意味著去掉重復(fù)值后就是馬鈴薯hsp20基因家族的成員，因?yàn)槠サ糁貜?fù)值后還需要進(jìn)一步研究每個(gè)基因所包含的結(jié)構(gòu)域泪喊，這就需要明確hsp20基因包含哪些保守domain。
好髓涯，先講兩次獲得的基因ID進(jìn)行合并刪除重復(fù)值袒啼。在Excel中操作。
通過(guò)合并刪除重復(fù)值后保留了60個(gè)基因，其實(shí)仔細(xì)看會(huì)發(fā)現(xiàn)這60個(gè)就是hmmsearch搜索的結(jié)果蚓再，包含了blastp得到的全部結(jié)果滑肉。這是因?yàn)槠鸪鯖](méi)有限定e值得原因，沒(méi)有關(guān)系摘仅。
繼續(xù)分析靶庙。
第六步：同樣的方式獲取這60個(gè)基因的蛋白序列。
注意看娃属，得到的基因ID后面有很多描述信息六荒，這是我們不需要的，因此還需要借助tbtools進(jìn)行ID簡(jiǎn)化矾端。
簡(jiǎn)化后就美好了很多恬吕。
但是問(wèn)題來(lái)了，我們確定了60個(gè)基因须床。明顯比文章中的48個(gè)基因要多，那是因?yàn)闆](méi)有進(jìn)行結(jié)構(gòu)域和分子量分析渐裂。
因此在進(jìn)行基因家族分析之前很有必要研究一下該基因家族的具體信息豺旬。
好，先進(jìn)行分子量計(jì)算柒凉，由于hsp20基因分子量在15-42kDa之間族阅，不在區(qū)間之內(nèi)的需要排除。
進(jìn)入https://web.expasy.org/compute_pi/提交剛才簡(jiǎn)化ID之后的蛋白序列文件即可膝捞。（但需要注意提交格式坦刀，這里每個(gè)基因一行）
（最右兩列一列的等電點(diǎn)，一列是分子量蔬咬。在excel中簡(jiǎn)單處理即可排除不在15-42kDa范圍內(nèi)的基因鲤遥。排除9個(gè)，保留51個(gè)林艘。通過(guò)smart查看結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)其中有兩個(gè)基因不包含hsp20結(jié)構(gòu)域盖奈，故最終鑒定該基因家族有49個(gè)成員。這段分析可以忽略狐援，由于使用的馬鈴薯基因組版本和文章中使用的不同钢坦，故在鑒定過(guò)程中會(huì)有差異，其實(shí)通過(guò)smart結(jié)構(gòu)域查看即可啥酱，無(wú)需刻意通過(guò)分子量進(jìn)行篩選爹凹。詳細(xì)的分析如果需要可自行探索，由于文章中后續(xù)涉及的套路式的分析過(guò)于簡(jiǎn)單镶殷，這里不再進(jìn)行）禾酱，如果朋友需要了解，可在后臺(tái)私信。
先寫(xiě)到這里宇植。
