Nat Methods | MIT美女科學(xué)家實現(xiàn)時空分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示亞細胞RNA動力學(xué)景觀
原創(chuàng)?M. B.?圖靈基因?2023-04-28 10:11?發(fā)表于江蘇
撰文：M. B.
IF=47.990
推薦度：?????
亮點：
1吧恃、細胞核/細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本分布的穩(wěn)態(tài)由基因特異性調(diào)節(jié)機制維持。
2、RNA轉(zhuǎn)錄膏斤、轉(zhuǎn)錄后加工和分配的動力學(xué)參數(shù)相對獨立。
3蔓涧、RNA動力學(xué)參數(shù)可以反映不同細胞類型的共享基因的共同特性和不同基因的差異特性丰刊。
近日，麻省理工學(xué)院的王瀟團隊在《Nature methods》雜志上發(fā)表了名為“Spatiotemporally resolved transcriptomics reveals the subcellular RNA kinetic landscape”的文章蝉稳。該文章報告了TEMPOmap——一種在單細胞水平上揭示跨時間和空間的亞細胞RNA譜的方法，揭示了RNA錯綜復(fù)雜的亞細胞動力學(xué)掘鄙，解決了現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的局限性問題耘戚。TEMPOmap整合了脈沖追蹤代謝標記與高度多重的三維原位測序，可以同時剖析單個RNA分子的年齡和位置操漠。作者利用TEMPOmap構(gòu)建了從轉(zhuǎn)錄和易位到降解的亞細胞RNA動力學(xué)景觀收津，發(fā)現(xiàn)了“動力學(xué)基因簇”饿这，為揭示新的時空基因調(diào)控原理提供了門戶。
細胞狀態(tài)和功能由基因表達的時空調(diào)控決定撞秋，這種異質(zhì)表達部分是通過精確的mRNA代謝和隨時間推移的運輸來實現(xiàn)的长捧。在單細胞水平上，系統(tǒng)地分析跨時間和空間的轉(zhuǎn)錄組能力對于理解細胞和組織中的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機制至關(guān)重要吻贿。然而串结，目前的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法無法同時捕獲RNA圖譜的空間和時間依賴性。
在這里舅列，為了在時間和空間上提供RNA生命周期的系統(tǒng)單細胞分析肌割，作者介紹了一種方法——時間分辨原位測序和作圖（TEMPOmap），可以在亞細胞分辨率下隨時間時空演變跟蹤轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法帐要。TEMPOmap同時整合了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的脈沖代謝標記和選擇性擴增把敞。利用脈沖追蹤標記，能夠在RNA生命周期中同時追蹤成百上千個基因的關(guān)鍵動力學(xué)參數(shù)榨惠，包括轉(zhuǎn)錄先巴、衰變、核輸出和細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位的速率冒冬。利用這些時空參數(shù)伸蚯，作者發(fā)現(xiàn)不同基因的mRNA在RNA生命周期的不同步驟和不同細胞周期階段受到不同的調(diào)控，最終發(fā)揮基因功能简烤。
1剂邮、時空分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)——TEMPOmap
TEMPOmap用5-乙炔基尿苷（5-EU）代謝標記培養(yǎng)細胞，使得在標記的mRNA上增加了一個生物正交的化學(xué)標記横侦。接下來挥萌，作者為每個mRNA物種設(shè)計了一個三探針組（splint, padlock and primer），選擇性地生成來源于代謝標記RNA的互補DNA擴增子枉侧，只有同時與所有三類探針結(jié)合的mRNA的互補DNA擴增子才會被擴增引瀑，因此允許通過兩步閾值策略以標記和序列特異性的方式選擇性檢測標記的mRNA群體。
為實現(xiàn)高度多重轉(zhuǎn)錄組檢測榨馁，將原位生成的cDNA擴增子文庫嵌入到水凝膠基質(zhì)中進行幾個循環(huán)的熒光成像憨栽，通過動態(tài)退火和連接進行測序，解碼基因編碼條形碼翼虫，循環(huán)完成后屑柔，對擴增子reads進行配準、解碼并進行3D分割珍剑。實現(xiàn)同時解析成百上千個基因的亞細胞和單細胞分析掸宛。
2、RNA壽命中的亞細胞RNA動力學(xué)景觀
為了進一步量化轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工不同階段的動力學(xué)招拙，作者評估了RNA壽命內(nèi)所有檢測到的轉(zhuǎn)錄本的4個關(guān)鍵動力學(xué)常數(shù)：合成（α）唧瘾、降解（β）措译、核輸出（λ）和胞漿轉(zhuǎn)位（γ）。作者將結(jié)果與已發(fā)表的使用EU標記的單細胞測序數(shù)據(jù)集作為基準饰序，結(jié)果顯示α和β值的中度相關(guān)性為0.30领虹，與獨立的單細胞測序數(shù)據(jù)集相當。
之后菌羽，作者對936個基因的四個參數(shù)進行了成對相關(guān)性分析掠械，發(fā)現(xiàn)每對參數(shù)之間的整體相關(guān)性較弱由缆，提示RNA轉(zhuǎn)錄注祖、轉(zhuǎn)錄后加工和分配的動力學(xué)參數(shù)相對獨立，并提出細胞周期分辨RNA動力學(xué)景觀：RNA產(chǎn)生的早期與α高度相關(guān)均唉；細胞核轉(zhuǎn)錄后加工過程中與λ具有中度相關(guān)性是晨；RNA生命周期接近結(jié)束時與γ的相關(guān)性較弱。除此之外舔箭，作者的分析表明λ在不同RNA物種之間差異很大罩缴，表明細胞核/細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本分布的穩(wěn)態(tài)是由基因特異性調(diào)節(jié)機制維持的。
3层扶、基于基因功能差異的RNA動力學(xué)策略
作者對800個基因進行了聚類箫章，聚類分析發(fā)現(xiàn)了5個不同動力學(xué)景觀的動力學(xué)基因簇有明顯的單細胞表達和隨時間分布的亞細胞。GO分析表明镜会，5個簇與截然不同的生物學(xué)和分子功能相關(guān)檬寂。之前的研究表明，許多編碼膜結(jié)合蛋白的mRNA錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面進行局部蛋白合成戳表。作者推斷編碼這些膜蛋白的RNA也可能在動態(tài)水平上被調(diào)節(jié)桶至，通過空間和時間定位控制以細胞周期依賴的方式執(zhí)行，結(jié)果作者發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)合成在G1期更活躍匾旭。
4镣屹、TEMPOmap在誘導(dǎo)多能干細胞和原代細胞中的適用性
最后，作者研究了是否可以使用TEMPOmap來研究異質(zhì)細胞類型中mRNA在不同階段的時空動力學(xué)价涝。為此女蜈，作者設(shè)計了兩組三探針，并將TEMPOmap應(yīng)用于兩種不同的生物系統(tǒng)：人誘導(dǎo)的多能干細胞衍生心肌細胞（hiPSC-CMs）和源自新生兒包皮的原代人類皮膚細胞色瘩，結(jié)果觀察到hiPSC-CMs和原代皮膚細胞中RNA的強烈空間重定位鞭光。
使用每種細胞類型的已知標記基因，作者確定了hiPSC-CMs培養(yǎng)物中的心肌細胞和心肌成纖維細胞群泞遗；皮膚細胞培養(yǎng)物中的黑素細胞惰许、角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞群。然后史辙，作者概括了每種細胞類型內(nèi)單細胞轉(zhuǎn)錄組譜在不同時間的軌跡汹买。對于hiPSC-CMs數(shù)據(jù)集佩伤，作者確定了三個動力學(xué)基因組。對于原代皮膚細胞數(shù)據(jù)集晦毙，動力學(xué)簇顯示了不同細胞類型的每個基因簇內(nèi)一致的RNA動態(tài)模式生巡，表明RNA動力學(xué)參數(shù)反映了不同細胞類型的共享基因的共同內(nèi)在特性。
技術(shù)路線
總體而言见妒，TEMPOmap是一種新的原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺孤荣，可同時分析單細胞中的時間和空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)，這是一種以前從未實現(xiàn)的亞細胞分辨率的多模態(tài)單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)须揣。作者證明了它能夠隨著時間的推移系統(tǒng)地檢測轉(zhuǎn)錄物的亞細胞分配和細胞質(zhì)易位盐股。更重要的是，作者的研究提供了單細胞水平上RNA亞細胞動力學(xué)的完整景觀耻卡，并揭示了RNA動力學(xué)如何促進細胞功能疯汁，如細胞周期進程。
教授介紹
王瀟卵酪，麻省理工學(xué)院化學(xué)系助理教授幌蚊，麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)博德研究所核心成員。2019年王瀟教授開始開發(fā)并應(yīng)用新的化學(xué)溃卡、生物物理和基因組工具溢豆，以更好地從分子水平了解大腦的功能障礙。在斯坦福瘸羡，她開發(fā)了將測序與成像相結(jié)合的分析完整組織中RNA的綜合方法漩仙，揭示了大腦中各種細胞類型的位置。
參考文獻
Ren J et al. “Spatiotemporally resolved transcriptomics reveals the subcellular RNA kinetic landscape” Nat Methods. Apr 10 2023. doi: 10.1038/s41592-023-01829-8.
