前言
三代測序錯誤率比較高，一般組裝后需要進行糾錯來提高準(zhǔn)確度隘梨。本次介紹使用Pilon通過引入二代測序數(shù)據(jù)來對三代基因組進行糾錯。
Pilon官網(wǎng)
https://github.com/broadinstitute/pilon/wiki
Pilon軟件安裝
#conda 安裝pilon
conda install -y pilon
#編譯安裝
wget https://github.com/broadinstitute/pilon/releases/download/v1.24/pilon-1.24.jar
chomd 755 pilon-1.24.jar
Pilon示例數(shù)據(jù)下載
#下載二代測序數(shù)據(jù)用于糾錯
wget \
-O illumina.sra \
https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR8482586/SRR8482586
本期需要糾錯的基因組選擇上期推文中Flye組裝的nanopore數(shù)據(jù)進行演示考余，即下文assembly.fasta
Pilon示例數(shù)據(jù)處理
fastq-dump --split-files --gzip illumina.sra
fastq-dump會將sra格式轉(zhuǎn)化成fastq格式饲窿，同時--gzip參數(shù)會對fastq進行壓縮，示例illumina.sra最終會被轉(zhuǎn)化為illumina_1.fastq.gz 和 illumina_2.fastq.gz
Pilon常用參數(shù)
--genome ： 設(shè)置需要糾錯的基因組
--fix : 參數(shù)可選snps佳遣、indels识埋、gaps、local零渐、all等（默認all）
--changes ： 列出糾錯位點
--frags ： 輸入paired-end比對文件（不同測序數(shù)據(jù)該選項不同，具體查看該軟件幫助文檔系忙；若不知道诵盼，可直接使用--bam
--output ： 輸入結(jié)果前綴
--outdir ： 輸出文件
--vcf : 生成vcf格式文件
Pilon使用案例
示例使用的是conda安裝的Pilon
#對拼接結(jié)果建立索引（如何獲得assembly.fasta詳見Flye三代基因組推文）
bwa index assembly.fasta
#illumina與assembly.fasta進行比對，生成assembly_illumina.sam結(jié)果文件
bwa mem -t 12 assembly.fasta illumina_1.fastq.gz illumina_2.fastq.gz > assembly_illumina.sam
#將assembly_illumina.sam進行排序银还，生成assembly_illumina.sorted.bam
samtools sort -@ 12 -O bam -o assembly_illumina.sorted.bam assembly_illumina.sam
#運行Pilon
pilon --genome assembly.fasta --fix all --changes --frags assembly_illumina.sorted.bam --output pilon --outdir pilon_result --vcf
可能會遇到下面的報錯信息风宁，這是由于軟件設(shè)定的內(nèi)存不足造成的
Exception in thread "main" java.lang.OutOfMemoryError: Java heap space
at org.broadinstitute.pilon.BaseSum.<init>(BaseSum.scala:24)
at org.broadinstitute.pilon.PileUp.<init>(PileUp.scala:27)
at org.broadinstitute.pilon.PileUpRegion.$anonfun$new$1(PileUpRegion.scala:30)
at org.broadinstitute.pilon.PileUpRegion$$Lambda$52/0x0000000100178840.apply$mcVI$sp(Unknown Source)
at scala.collection.immutable.Range.foreach$mVc$sp(Range.scala:190)
at org.broadinstitute.pilon.PileUpRegion.<init>(PileUpRegion.scala:30)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeRegion.initializePileUps(GenomeRegion.scala:150)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.$anonfun$processRegions$4(GenomeFile.scala:104)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.$anonfun$processRegions$4$adapted(GenomeFile.scala:102)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile$$Lambda$51/0x0000000100169840.apply(Unknown Source)
at scala.collection.immutable.List.foreach(List.scala:333)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.processRegions(GenomeFile.scala:102)
at org.broadinstitute.pilon.Pilon$.main(Pilon.scala:111)
at org.broadinstitute.pilon.Pilon.main(Pilon.scala)
解決辦法如下：
#查詢pilon路徑
which pilon
#修改pilon配置
vim /home/xiaoli/miniconda3/envs/NGS/bin/pilon
修改下圖紅色框，將 -Xmsg和-Xmx對應(yīng)的數(shù)值調(diào)大蛹疯，再次運行即可成功戒财。
pilon debug.png
Pilon主要結(jié)果文件
pilon.changes #該文件列出了糾錯的位點
pilon.fasta #最終糾錯后文件
查看Pilon糾錯效果
#有多少行代表有多少錯誤被糾正
wc -l pilon.changes
#統(tǒng)計糾錯前后文件信息
seqkit stats pilon.fasta assembly.fasta
PS.糾錯可以進行多次，即：將第一次糾錯結(jié)果作為第二次需要糾錯的文件再次糾錯
