什么是染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）？
染色質(zhì)免疫共沉淀法是在保持組蛋白和DNA聯(lián)合的同時(shí)刚陡，通過運(yùn)用對(duì)應(yīng)于一個(gè)特定組蛋白標(biāo)記的生物抗體惩妇，染色質(zhì)被切成很小的片斷，并沉淀下來筐乳。這項(xiàng)技術(shù)主要用來分析目標(biāo)基因有沒有活性歌殃、或者分析一種已知蛋白(轉(zhuǎn)錄因子)的靶基因有哪些。真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在蝙云。
CHIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用氓皱，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且勃刨，CHIP與其他方法的結(jié)合波材，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合身隐，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)廷区；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。
一贾铝、CHIP常見用途
1隙轻、DNA甲基化
脊椎動(dòng)物的DNA甲基化一般發(fā)生在CpG位點(diǎn)(胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(diǎn),即DNA序列中胞嘧啶后緊連鳥嘌呤的位點(diǎn))。經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶垢揩。人類基因中約80%-90%的CpG位點(diǎn)已被甲基化,但是在某些特定區(qū)域,如富含胞嘧啶和鳥嘌呤的CpG島則未被甲基化玖绿。這與包含所有廣泛表達(dá)基因在內(nèi)的56%的哺乳動(dòng)物基因中的啟動(dòng)子有關(guān)。1%-2%的人類基因組是CpG群,并且CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比叁巨。
2斑匪、蛋白質(zhì)甲基化
蛋白質(zhì)甲基化一般指精氨酸或賴氨酸在蛋白質(zhì)序列中的甲基化。精氨酸可以被甲基化一次(稱為一甲基精氨酸)或兩次(精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMTs)將兩個(gè)甲基同時(shí)轉(zhuǎn)移到精氨酸多肽末端的同—個(gè)氮原子上成為非對(duì)稱性甲基精氨酸,或者在每個(gè)氨端各加—個(gè)甲基成為對(duì)稱性二甲基精氨酸)賴氨酸經(jīng)賴氨酸轉(zhuǎn)移酶的催化可以甲基化一次俘种、兩次或三次。在組蛋白中,蛋白質(zhì)甲基化昰被研究最多的一類绝淡。在組蛋白轉(zhuǎn)移酶的催化下,S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到組蛋白宙刘。某些組蛋白殘基通過甲基化可以抑制或激活基因表達(dá),從而形成為表觀遺傳。蛋白質(zhì)甲基化是翻譯后修飾的一種形式牢酵。
3悬包、組蛋白修飾
在保持組蛋白和DNA聯(lián)合的同時(shí),染色質(zhì)被切成很小的片斷,通過運(yùn)用對(duì)應(yīng)于一個(gè)特定組蛋白標(biāo)記的生物抗體,將目標(biāo)片段(發(fā)生組蛋白特異標(biāo)記的片段)沉淀下來。此外H4—K20的甲基化與基因沉默相關(guān),H3—K36和H3—K79的甲基化與基因激活有關(guān)馍乙。但應(yīng)當(dāng)注意的是,甲基化個(gè)數(shù)與基因沉默和激活的程度相關(guān)布近。
4垫释、DNA甲基化
活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,通過對(duì)目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
組蛋白修飾包括組蛋白甲基化和乙醭徘疲化棵譬，都用 ChIP assay那是如何知道我是想檢測甲基化水平還是乙酰化水平预伺？
抗體→甲基化轉(zhuǎn)移酶/乙醵┫蹋化酶特異性抗體.
二、CHIP原理
利用抗體專一性特征酬诀，檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用脏嚷。
1、染色質(zhì)免疫共沉淀
研究蛋白質(zhì)與核酸相互結(jié)合的技術(shù)瞒御。
甲醛固定時(shí)父叙，相互靠近的蛋白與蛋白，蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵肴裙。
細(xì)胞內(nèi)趾唱，能夠相互結(jié)合的蛋白與基因靠的比較近，或者契合在一起践宴。此時(shí)甲醛處理能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵而綁定在一起鲸匿。
2、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)
染色質(zhì)由緊密聚集的組蛋白和DNA阻肩，以及結(jié)合在DNA上的其他物質(zhì)組成带欢。
3、染色質(zhì)免疫共沉淀
利用甲醛交聯(lián)蛋白與核酸烤惊，使蛋白質(zhì)抗體沉淀蛋白-核酸復(fù)合物后乔煞，檢測蛋白質(zhì)上的核酸。
三柒室、CHIP 示例
1渡贾、 CHIP-qPCR 研究 VCaP細(xì)胞在有或無E2處理時(shí) ERα 聚集到 NEAT1 啟動(dòng)子區(qū)。
IgG或ERα抗體沉淀下復(fù)合物后雄右，針對(duì)猜測的DNA序列設(shè)計(jì)引物檢測是否有特定的DNA序列與Erα結(jié)合空骚。適用于想要研究某個(gè)特定蛋白是否結(jié)合自己猜測的基因。需要針對(duì)基因不同區(qū)段設(shè)計(jì)引物擂仍。
2囤屹、 CHIP-seq 研究 SW480細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子P53結(jié)合的mRNA、蛋白質(zhì)逢渔、基因肋坚。
細(xì)胞經(jīng)處理后進(jìn)行CHIP，利用P53抗體沉淀復(fù)合物，然后分離純化復(fù)合物內(nèi)核酸進(jìn)行高通量測序智厌。適用于想要研究某個(gè)特定蛋白诲泌，但是不知道結(jié)合的基因有哪些。
3铣鹏、 CHIP-qPCR 研究細(xì)胞在轉(zhuǎn)染sh-RNA或?qū)φ蘸蠓笊ǎ謩e采用RA處理后H3K56Ac結(jié)合的lncRNA和基因細(xì)胞經(jīng)處理后進(jìn)行CHIP，利用H3K56Ac抗體沉淀復(fù)合物吝沫，然后分離純化復(fù)合物內(nèi)核酸呻澜，使用預(yù)測的引物檢測lncRNA或基因富集。適用于研究或驗(yàn)證與lncRNA結(jié)合的蛋白惨险。
