安裝

conda安裝

conda install -c milaboratories mixcr

普通安裝

在Mac OS X上使用Homebrew或者在Linux系統(tǒng)上使用linuxbrew安裝

brew install milaboratory/all/mixcr

將已經(jīng)安裝的MiXCR更新到最新版本

brew update
brew upgrade mixcr

手動安裝

1. 在release page下載最新版穩(wěn)定編譯的MiXCR
2. 解開壓縮包
3. 將解壓縮生成的文件夾添加到環(huán)境變量中

• 添加mixcr腳本的符號鏈接到bin文件夾
• 或者在執(zhí)行腳本中指定MiXCR的全路徑來直接使用

快速使用

綜述

典型的MiXCR工作流程主要由三個部分構(gòu)成：

• align：將測序結(jié)果比對到T細(xì)胞或B細(xì)胞受體的V、D、J铅搓、C基因參考序列上
• assemble：利用前一步驟獲得的比對結(jié)果拼接clonotypes（為了提取特定的基因區(qū)域信息次企，比如CDR3）
• export：輸出比對結(jié)果（exportAlignments模塊）或者clones信息（exportClones模塊）昧廷，生成可讀文件

MiXCR的assemble模塊有幾種不同的拼接方法可以選擇：

• assembleContigs：拼接完整的TCR或者IG受體clonotype序列
• 對于RNA-Seq or non-targeted DNA data, 工作流程可能包括以下兩部分：
  • assemblePartial：將有重疊區(qū)域的序列片段拼接成相對較長的包含CDR3區(qū)域的contigs
  • extend: 估算測序和比對質(zhì)量較好但長度較短的TCR比對序列的germline序列

為了簡化輸入命令被碗，MiXCR提供了analyze命令模塊奏属，打包了整個分析流程

實例

默認(rèn)流程 / multiplex-PCR

利用analyze amplicon命令分析multiplex-PCR擴增的TCR/BCR基因DNA片段

mixcr analyze amplicon --species hs --starting-material dna --5-end v-primers --3-end j-primers --adapters adapters-present --receptor-type IGH input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

只有一個參數(shù)修改為非默認(rèn)值（--receptor-type IGH），這個參數(shù)的改變可以讓MiXCR 調(diào)用針對B細(xì)胞優(yōu)化的比對模塊并且只輸出IGH序列纵搁。其實這個參數(shù)是可以缺省的吃衅，缺省狀態(tài)下MiXCR會調(diào)用默認(rèn)的比對模塊并輸出樣本中所有的TCR/BCR序列。
生成的文件（analysis.clonotypes.IGH.txt）是一個tab分隔的表格腾誉，包含CDR3序列拼接的所有clonotypes（克隆豐度徘层，CDR3序列， VDJ基因等）利职。

詳細(xì)流程

利用analyze amplicon模塊與執(zhí)行下面的命令是等價的

> mixcr align -s hs -p kAligner2 input_R1.fastq input_R2.fastq alignments.vdjca
... Building alignments
> mixcr assemble alignments.vdjca clones.clns
... Assembling clones
> mixcr exportClones --chains IGH clones.clns clones.txt
... Exporting clones to tab-delimited file

基于5’RACE擴增實驗的數(shù)據(jù)分析

考慮基于5’RACE（一個read覆蓋CDR3區(qū)域和臨近序列趣效，另一個read覆蓋V基因的5’UTR和下游序列）實驗準(zhǔn)備的IGH基因cDNA文庫雙端測序的數(shù)據(jù)處理流程，全部分析流程可以通過analyze amplicon命令實現(xiàn)

> mixcr analyze amplicon --species hs --starting-material rna --5-end v-primers --3-end j-primers --adapters adapters-present input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

結(jié)果文件（analysis.clonotypes.<chains>.txt）包含詳細(xì)的clonotypes信息猪贪。

詳細(xì)流程

利用analyze amplicon模塊將執(zhí)行下面的流程：

1. Align 把原始序列比對到IGH基因的VDJ基因序列片段上

> mixcr align -s hs -OvParameters.geneFeatureToAlign=VTranscript --report analysis.report input_R1.fastq input_R2.fastq analysis.vdjca

用來比對V基因的非默認(rèn)基因特征（-OvParameters.geneFeatureToAlign=VTranscript）同時利用了兩個reads的信息跷敬，為了讓MiXCR利用CDR3反向read比對V基因的5’UTRS和部分5’端編碼區(qū)域。MiXCR還會生成report文件（通過可選參數(shù)--report指定）热押，其中包含的具體運行統(tǒng)計信息如下

Analysis Date: Mon Aug 25 15:22:39 MSK 2014
Input file(s): input_r1.fastq,input_r2.fastq
Output file: alignments.vdjca
Command line arguments: align --report alignmentReport.log input_r1.fastq input_r2.fastq alignments.vdjca
Total sequencing reads: 323248
Successfully aligned reads: 210360
Successfully aligned, percent: 65.08%
Alignment failed because of absence of V hits: 4.26%
Alignment failed because of absence of J hits: 30.19%
Alignment failed because of low total score: 0.48%

可以利用exportAlignments命令將比對生成的二進(jìn)制結(jié)果（analysis.vdjca）轉(zhuǎn)化為可讀的文本文件西傀。

2. Assemble 拼接clonotypes

> mixcr assemble --report analysis.report analysis.vdjca -a analysis.clna

這一步驟會校正PCR和測序錯誤并建立clonotypes，默認(rèn)情況下clonotypes會拼接CDR3序列桶癣；可以通過設(shè)置assemble模塊的參數(shù)來制定其他的基因區(qū)域（參考assemble documentation）拥褂，可選的report文件analysis.report包含各種調(diào)試信息

Analysis Date: Mon Aug 25 15:29:51 MSK 2014
Input file(s): alignments.vdjca
Output file: clones.clns
Command line arguments: assemble --report assembleReport.log alignments.vdjca clones.clns
Final clonotype count: 11195
Total reads used in clonotypes: 171029
Reads used, percent of total: 52.89%
Reads used as core, percent of used: 92.04%
Mapped low quality reads, percent of used: 7.96%
Reads clustered in PCR error correction, percent of used: 0.04%
Clonotypes eliminated by PCR error correction: 72
Percent of reads dropped due to the lack of clonal sequence: 2.34%
Percent of reads dropped due to low quality: 3.96%
Percent of reads dropped due to failed mapping: 5.87%

3. Export 將包含clones列表的二進(jìn)制文件（analysis.clna）導(dǎo)出為可讀的文本文件

> mixcr exportClones --chains TRA analysis.clna analysis.clonotypes.TRA.txt
> mixcr exportClones --chains TRB analysis.clna analysis.clonotypes.TRB.txt
> ...

導(dǎo)出的clones信息如下表所示

導(dǎo)出的各種選項詳見export文檔，上述的所有步驟都可以根據(jù)特定研究的分析流程進(jìn)行個性化設(shè)置牙寞。

高質(zhì)量全長IG免疫組庫分析

對于基于cDNA全長的IG免疫組庫分析饺鹃，我們一般推薦UMI標(biāo)簽制備文庫并使用非對稱雙端測序350 bp + 100 bp Illumina MiSeq測序方法（詳情參考Nature Protocols paper）。這種方法可以獲得長片段高質(zhì)量測序結(jié)果间雀，而且可以利用MiGEC software有效去除PCR和測序錯誤悔详。獲得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步利用MiXCR處理，以提取全長IGH或IGL組庫惹挟。
全部分析流程可以使用analyze amplicon命令

> mixcr analyze amplicon --species hs --starting-material rna --5-end v-primers --3-end j-primers --adapters adapters-present --receptor-type BCR --region-of-interest VDJRegion --only-productive --align "-OreadsLayout=Collinear" --assemble "-OseparateByC=true" --assemble "-OqualityAggregationType=Average" --assemble "-OclusteringFilter.specificMutationProbability=1E-5" --assemble "-OmaxBadPointsPercent=0" input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

這一步驟會生成以下結(jié)果文件（analysis.clonotypes.IGH.txt茄螃，analysis.clonotypes.IGK.txt和analysis.clonotypes.IGL.txt），其中包括詳細(xì)的clonotypes信息匪煌。這里我們要強調(diào)幾個可選參數(shù)：

• --receptor-type BCR 需要MiXCR調(diào)用B細(xì)胞優(yōu)化的比對模塊（等同于對align模塊使用-p kAligner2參數(shù)）并且只輸出IG序列责蝠。
• region-of-interest VDJRegion 對assemble模塊使用-OassemblingFeatures=VDJRegion參數(shù)
• --only-production 在export輸出的clonotypes中過濾掉out-of-frame和stop codon
• --align <option> 在align過程中設(shè)置其他的參數(shù)
• --assemble <option> 在assemble過程中設(shè)置其他參數(shù)

詳細(xì)流程

使用analyze amplicon命令等同于執(zhí)行下面的MiXCR步驟

1. 合并雙端reads并比對alignment：MiXCR的align模塊可以合并雙端reads并比對到參考的V/D/J和C基因上党巾，我們推薦使用KAligner2處理IG數(shù)據(jù)

> mixcr align -p kaligner2 -s hs -r alignmentReport.txt -OreadsLayout=Collinear -OvParameters.geneFeatureToAlign=VTranscript read_R1.fastq.gz read_R2.fastq.gz alignments.vdjca

選項-s用來指定物種（e.g. homo sapiens - hsa, mus musculus - mmu）萎庭，參數(shù)-OreadsLayout 用來設(shè)定reads方向（Collinear, Opposite, Unknown）。這里需要注意的是齿拂，經(jīng)過MiGEC分析的雙端reads方向是Collinear驳规。
除了KAligner2，也可以使用默認(rèn)的MiXCR比對模塊署海，只是也許會忽略一些亞變異類型吗购，這些變異類型是由V基因片段的若干核苷酸插入形成的医男。

2. Assemble拼接clones

> mixcr assemble -r assembleReport.txt -OassemblingFeatures=VDJRegion -OseparateByC=true -OqualityAggregationType=Average -OclusteringFilter.specificMutationProbability=1E-5 -OmaxBadPointsPercent=0 alignments.vdjca clones.clns

-OseparateByC=true 把clones按照不同的抗體亞型分類
-OcloneClusteringParameters=null 關(guān)閉基于頻率的PCR錯誤校正
根據(jù)數(shù)據(jù)質(zhì)量，可以通過設(shè)置-ObadQualityThreshold參數(shù)來調(diào)節(jié)輸入數(shù)據(jù)的閾值來優(yōu)化clonotypes的提取捻勉。

3. Export輸出clones結(jié)果

> mixcr exportClones -c IGH -o -t clones.clns clones.txt

選項-o和-t用于過濾包含out-of-frame和stop codon的clonotypes镀梭，-c指定哪條鏈的數(shù)據(jù)應(yīng)該被提取（e.g. IGH, IGL）踱启。

RNA-Seq數(shù)據(jù)分析

MiXCR可以用于提取RNA-Seq數(shù)據(jù)中TCR和BCR的CDR3組庫报账，提取效率取決于樣本紅T/B細(xì)胞的豐度和測序長度。推薦2x150bp或者2x100bp的雙端測序方法埠偿。不過在雙端2x50bp的RNA-Seq數(shù)據(jù)（比如腫瘤樣本中）透罢，主要clonotypes信息也可以被提取。
單一analyze shotgun命令可以完成分析

> mixcr analyze shotgun --species hs --starting-material rna --only-productive input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

生成的結(jié)果文件（analysis.clonotypes.TRA.txt, analysis.clonotypes.IGH.txt等）包含clonotypes的詳細(xì)信息冠蒋。

詳細(xì)流程

1. Align 比對reads

> mixcr align -s hs -p rna-seq -OallowPartialAlignments=true data_R1.fastq.gz data_R2.fastq.gz alignments.vdjca

所有mixcr align的參數(shù)都可以在這里使用（比如-s來指定物種）：
-OallowPartialAlignments=true選項保留部分比對結(jié)果用于后續(xù)的assemblePartial模塊

2. Assemble parial reads拼接部分reads

> mixcr assemblePartial alignments.vdjca alignmentsRescued.vdjca

為了獲得包含CDR3全長序列的拼接reads羽圃，建議使用迭代mixcr的assemblePartial模塊多次迭代拼接結(jié)果。多次迭代需要-p參數(shù)抖剿，根據(jù)我們的經(jīng)驗朽寞，兩次迭代后結(jié)果最優(yōu)

> mixcr assemblePartial alignments.vdjca alignmentsRescued_1.vdjca
> mixcr assemblePartial alignmentsRescued_1.vdjca alignmentsRescued_2.vdjca

3. 利用已有V和J基因延長TCR比對結(jié)果，基于germline序列不全覆蓋度不完全的CDR3s

> mixcr extendAlignments alignmentsRescued_2.vdjca alignmentsRescued_2_extended.vdjca

4. Assemble拼接clones

> mixcr assemble alignmentsRescued_2_extended.vdjca clones.clns

所有mixcr assemble的參數(shù)都可以在這里使用：

• 對于低質(zhì)量數(shù)據(jù)斩郎，建議降低輸入質(zhì)量閾值（e.g. -ObadQualityThreshold=15）
• 為了克隆豐度與錯誤校正算法相結(jié)合愁憔，增加下面的選項：-OaddReadsCountOnClustering=true

5. Exporting導(dǎo)出clones

> mixcr exportClones -c TRA -o -t clones.clns clones.txt

可以指定導(dǎo)出感興趣的免疫受體鏈（-c TRA 或者 -c TRB等），也可以去除包含out-of-frame（選項-o）和stop codon的突變體（選項-t）孽拷。

參數(shù)解讀

結(jié)果解讀

輸出文件包含內(nèi)容